昆明小鼠卵母细胞玻璃化冷冻保存的分析-妇产科学专业论文.docx

墨盛垄垦堕!：塾塑竺塑丝蔓壁丝堡堕堡查箜竺塑昆明小鼠卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究 墨盛垄垦堕!：塾塑竺塑丝蔓壁丝堡堕堡查箜竺塑 昆明小鼠卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究 摘要 本研究利用玻璃化冷冻技术保存昆明小鼠成熟卵母细胞，比较了不同的 冷冻保护i}1](cryoprotectant agent，CPA)署H不同的冷冻解冻方法对卵母细胞存活 率、受精率及囊胚率的影响，并利用胚胎移植技术得到了产仔的结果，为小 鼠卵母细胞冷冻保存提供了简便有效的技术方法。 1 同一浓度的六种冷冻保护剂对卵母细胞的毒性作用。 分别以甘油(GLY)、乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)、1，2一丙二醇(PrOH)、 GLY+PrOH、EG+DMSO作为冷冻保护液(vitrification solution，VS)处理卵母细胞： 对照组只经解冻液处理。结果显示EG+DMSO处理组的卵母细胞存活率(69．2％)、 受精率(47．3％)和囊胚率(38．8％)显著高于其它五组(PO．01)，但不及对 照组(PO．01)。所以EG+DMSO作为冷冻保护剂对卵母细胞的毒性较小。 2 同一种类三种浓度的冷冻保护剂对卵母细胞的毒性作用。 分别以IO％EG+IO％DMSO、20％EG+20％DMSO、30％EG+30％DMSO这三种溶液作 为VS2处理卵母细胞，对照组只经解冻液处理。结果显示IO％EG+IO％DMSO和 20％EG+20％DMSO两组之间没有显著差异(PO．05)，它们的存活率(70．3％、 65．O％)、受精率(58．7％、51．9％)和囊胚率(44．3％、40．5％)显著高于 30％EG+30％DMSO处理组(PO．01)，但不及对照组(PO．01)。所以20％EG+20％DMSO 作为VS2具有较高的浓度并且对卵母细胞的毒性较小。 3冷冻液中不同浓度的NBS对卵母细胞冻存效果的影响。 分别以0、10％、20％、30％的新生小牛血清(new born calf serum，NBS) 作为vS的血清添加浓度，结果显示20％NBS处理组的卵母细胞存活率(40．8％)、 受精率(33．5％)和囊胚率(24．9％)显著高于其他三个处理组(PO．01)。 4在冷冻液和解冻液中平衡不同时间对卵母细胞冻存效果的影响。 冷冻时在VSl中平衡2分钟处理组的卵母细胞存活率(42．5％)、受精率 (35．1％)和囊胚率(26．1％)显著高于平衡1分钟和3分钟的处理组(PO．01)； 在VS2中平衡20秒钟和30秒钟处理组之间的卵母细胞存活率(45．1％、43．7％)、 受精率(33．3％、29．4％)和囊胚率(26．6％、23．4％)无显著差异(PO．05)， 但都高于平衡10秒钟的处理组(PO．01)。解冻时在解冻液中各平衡5分钟 塑茎直盔兰堡主兰竺丝苎和7分钟处理组之间的卵母细胞存活率(77．5％、75．5％)、受精率(58．5％、 塑茎直盔兰堡主兰竺丝苎 和7分钟处理组之间的卵母细胞存活率(77．5％、75．5％)、受精率(58．5％、 60．5％)和囊胚率(46．O％、43．6％)无显著差异(P0．05)，但都高于各平衡3 分钟的处理组(P0．01)。 5在冷冻液和解冻液中平衡时的温度对卵母细胞冻存效果的影响。 当在冷冻液中平衡的温度为25℃、在解冻液中平衡的温度为25℃或37 ℃时，卵母细胞的存活率(74．6％、72．1％)、受精率(53．4％、50．6％)和囊胚 率(42．6％、41．6％)显著高于在冷冻液中平衡时温度为37℃、在解冻液中平 衡时温度为25℃或37℃的两个处理组(P0．01)。 6卵丘对卵母细胞冻存效果的影响。 用透明质酸酶分别消化卵丘一卵母细胞复合体0分钟(未去卵丘)、5分钟 (去掉约一半卵丘)、10分钟(去掉全部卵丘)，然后进行冻存和受精，结果 显示，0分钟和5分钟这两个处理组的卵母细胞存活率(75．8％、73．O％)、受 精率(50．3％、46．3％)和囊胚率(40．8％、36．2％)显著高于10分钟的处理组 (P0．01)。 7卵母细胞解冻后在受精液中恢复不同时间对其冻存效果的影响。 将解冻后的卵母细胞在受精液TYH中分别停留0分钟、15分钟、30分钟 后再进行体外受精，结果显示恢复15分钟和30分钟这两个处理组的卵母细 胞受精率(84．4％、87．9％)和囊胚率(65．8％、67．6％)显著高于恢复0分钟 的处理组(P0．01)，但它们三者之间的存活率并无显著差异(P0．05)。 8不同冷冻方法对卵母细胞冻存效果的影响。 分别用开放式拉管(OPS)法、尼龙环(Nylon．100p)法、微滴(Mini．drop) 法冻存卵母细胞，结果显示这三种方法在卵母细胞的受精率(86．6％、82．8％、 85．0％)和囊胚率(70．3％、65