5.3 血红蛋白的提取和分离 2014.3.9.ppt

21世纪初，工程浩大的国际人类基因组计划正式完成，但仅仅测绘出基因组序列还远远不够，必须对基因组的编码产物——蛋白质组进行深入的研究才能真正实现基因诊断和基因治疗，近年来，我国科学家在蛋白质组研究领域取得了令人瞩目的成绩，首次由我国科学家领导的国际重大科研合作项目人类肝脏蛋白质组计划已经取得阶段性进展。 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 样品的加入和洗脱的操作不正确的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 A． 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面 氨基酸的结合方式:脱水缩合 肽键 C H COOH R3 H N OH H C C H R1 NH2 C O C H R2 H N O 二肽 H2O H2O 氨基酸的结合方式:脱水缩合 C C H R1 NH2 C O C H R2 H N O 肽键 二肽 C H COOH R3 H N H2O 肽键 三肽 以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠，形成有一定空间结构的蛋白质分子。 H2O 8、分子结构 7、肽键 CO NH 氨基酸 肽链 蛋白质 脱水缩合 盘曲折叠 （一条或者多条） 10、生理功能 细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者 氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别 9、蛋白质结构的多样性 ①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个 ②若有n个氨基酸分子缩合成m条肽链,则可形成 ________个肽键,脱去______个水分子，至少有氨基和羧基各 ____个 11、相关计算 n - m n - m m 思考：血红蛋白共有574个氨基酸，4条肽链，至少有氨基、羧基多少？ ③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构 ④关于蛋白质相对分子量的计算： n 个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为______________ n ·a - (n - m) ·18 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 5倍体积生理盐水 搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色 1、 洗涤红细胞 (2)洗涤过程 （一）样品处理 （1）洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。 1、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。 问： 1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？ 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？ 3、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤， 能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？ 1、红细胞的洗涤 2、重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 （一）样品处理 2、血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟,细胞破裂释放出血红蛋白。 磁力搅拌器 搅拌器转子 蒸馏水：使红细胞吸水胀破 甲苯：溶解红细胞的细胞膜 充分搅拌的目的：加速红细胞的破裂 搅拌器正在工作 红细胞破 碎混合液 高速离心 10min 离心管 滤纸 过滤 脂类物质 烧杯 3 分离血红蛋白 20mmol/L磷酸缓冲液 （二） 透析血红蛋白——粗分离 透析的目的：去除血红蛋白溶液中的小分子杂质 透析的原理： 透析袋是半透膜，能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。 透析袋 透析的过程： 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。 1.凝胶色谱柱的制作 2.凝胶色谱柱的装填 3.样品的加入和洗脱 （三）血红蛋白的纯化-凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 ①主体：取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管， 两端用砂纸磨平。 ③底塞(带样品出口) ： 橡皮塞上部打孔 挖出凹穴 安装移液管头部(样品出口) 在凹穴上方依次覆盖尼龙网和尼龙纱，包好 ②顶部：安装了玻璃管的橡