酶的提取与分离纯化0916解析.ppt

* 2. 操作：（SDS及PAGE，即变性及非变性） 1）制胶: （变性：buffer 中加0.4%SDS） a. 分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液： Acr:Bis=29:1，分离胶buffer, TEMED, AP, 水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。 b. 浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。 * 2）样品制备： a. PAGE: 样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝） b. SDS: 样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2~5min， 以除去亚稳态聚合。 3）加样及电泳： SDS: 电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。 * 4）固定及染色 a.固定：将凝胶浸于7％乙酸或12.5％三氯乙 酸中固定蛋白质组分。 b.染色： 考马斯亮蓝染色法 银染法（灵敏度比前者高100倍） 其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff试剂（糖蛋白）。 * 电泳胶实例 * 四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF ) 利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。 * 1. 原理 两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。 * 两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保 持稳定的pH梯度。 (2)导电性能好——以保持电场强度的均匀性。 (3)分子量小——电泳后易分离除去。 (4)化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。 * 等电聚焦电泳 * 2. 操作： 1）凝胶 配制：凝胶浓度T为5％~7.5％（C=3% 左右） 2）加样：任意位置 * 3）电泳： 阳极：磷酸溶液 电极溶液 阴极：NaOH溶液 只有在凝胶两端给予高电压（600V）时，才能获得较好的分辨率。而高电压的维持需要有效的凝胶冷却系统。 4）固定及染色：TCA固定，考马斯亮蓝染色。 * 5）等电点测定： Marker与未知样品同时电泳染色后，以pH值为纵轴，距阴极距离为横轴，做pH梯度标准曲线，据未知蛋白迁移距离可推知pI。 IEF测定蛋白质pI * 第四节 酶的浓缩、干燥与结晶 一、酶的浓缩 (一)蒸发浓缩 图 4-60 减压蒸发浓缩的简易装置 1蒸馏瓶2毛细管3螺旋夹4橡皮管5温度计6出水口7冷凝器8进水口9连接管10抽气口11接收瓶 * （二） 超滤浓缩 超滤(ultrafiltration) 浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的 。 图4-61 酶的超滤浓缩 * （三）吸水剂 1.胶过滤浓缩 ： 利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25或G-50等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。 * 2.聚乙二醇浓缩： 聚乙二醇（polyethylene glycol），简称PEG 。 利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。 一般用分子量大的PEG,如PEG 6,000和PEG 20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。 * 6. 应用 1）纯化带“标签 （tag）”蛋白 如：带有 His-tag，GST-tag 蛋白纯化 2) 抗体及Fc融合蛋白纯化 Protein A * (六) 反相层析——高效（压）液相层析（HPLC 常用于分析） 反相层析原理： 同疏水层析，常用于高效液相层析 特点： ①使用的固相支持剂颗粒很细（ 5um），表面积很大,因而分辨率很高。 ②溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 固定相（柱填料）： 常用坚硬、耐高压，粒度小的硅胶。 * 反相色谱中，蛋白质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，先被洗脱下来。 即：随着甲醇梯度