酶的提取与分离纯化.ppt

0102原理：SDS是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，可在标准曲线上求得分子量。2.操作：（SDS及PAGE，即变性及非变性）1）制胶:（变性：buffer中加0.4%SDS）a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。★PAGE:样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝）SDS:样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2-5min，以除去亚稳态聚合。2）样品制备：1SDS:电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。3）加样及电泳：24）固定及染色a.固定：将凝胶浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白质组分。b.染色：考马斯亮蓝染色法银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff试剂（糖蛋白）。★等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续pI的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。自学第五节酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩1蒸发浓缩图4-60减压蒸发浓缩的简易装置1蒸馏瓶2毛细管3螺旋夹4橡皮管5温度计6出水口7冷凝器8进水口9连接管10抽气口11接收瓶★2超滤浓缩超滤浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。图4-61酶的超滤浓缩★吸水剂胶过滤浓缩利用葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。聚乙二醇浓缩：聚乙二醇（polyethyleneglycol），简称PEG。利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。一般用分子量大的PEG,如PEG6,000和PEG20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。12反复冻融浓缩利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。沉淀法盐析法，有机溶剂法结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。三、酶的结晶酶的干燥多采用冷冻干燥法。将酶溶液在较低温度下（-10℃到-50℃）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。二、酶的干燥贰壹结晶的条件酶的纯度:纯度越高越易结晶（50％）酶的浓度（恰到好处）:浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。结晶温度4.溶液pH离子强度6.晶核结晶时间第五节纯化方案的设计与评价一、纯化方案的设计1纯化方法的选择依据根据有效成分和杂质之间理化性质的差异▼调节溶解度：沉淀法▼根据分子大小、形状的不同：离心分离，膜分离，凝胶过滤▼根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳▼根据专一性结合的方法：亲和层析▼其它：吸附层析，疏水层析★纯化方法的排序先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。0102纯化方案的评价酶活力测定：酶活力(enzymeactivity)又称酶活性，即单位时间内酶促反应的产物生成量.是酶催化某一化学反应的能力。0.6/0.416=1.449.8/0.416=2