基质辅助激光解析飞行时间质谱分析条件及准确度对蛋白质数据库搜索结果的影响.doc

 分析化学 ( FENX I HUAXU E) 研究报告 Ch ine se Jou rna l of A na lytica l Chem istry 第 37卷 2009年 3月 第 3期 319～324 基质辅助激光解析飞行时间质谱分析条件及 准确度对蛋白质数据库搜索结果的影响 邱宗荫 3 1 彭咏波 1 马永平 2 丁世家 4 夏永鹏 1 , 3 1 (重庆医科大学药学院药物分析教研室 ,重庆 400016) 2 (重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室 ,重庆 400016) 3 (重庆市食品药品监督管理局 ,重庆 400042 ) 4 (重庆医科大学医学检验系 ,重庆 400016 ) 摘 要 考察了基质辅助激光解析飞行时间质谱获得肽质量指纹谱 ( PM F)时主要分析条件及准确度对蛋白 质数据库搜索结果的影响 。将牛血清白蛋白 (B SA )经聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SD S2PA GE ) 分离 、酶解 ; 肽段经 质谱分析得 PM F数据 ;用 M S2F it引擎在相同数据库及参数下搜索 。得出 : ( 1 )激光脉冲击打次数在 300 次以 前时 ,蛋白序列和肽段覆盖率逐步增加 ;当击打 400次时 ,覆盖率呈下降趋势 ; ( 2 )随着激光强度增加 ,目标蛋 白得分 、氨基酸序列和肽段的覆盖率逐步增加 ,但当强度增到 1413 时 ,则呈现降低趋势 ; ( 3 )随延迟时间的增 加 ,肽覆盖率呈递增趋势 ,但当达 260 n s后呈下降趋势 。按照优化的分析条件对同一位点重复 3次 ,重复性良 好 。通过对质谱数据准确度的考察 ,发现以 M ix2为外标 ,数据跟标准值差异越小时 ,则经其校正后的肽段数 据所搜索目标蛋白的得分越高 、排序靠前 、检出预选蛋白个数越少 ,可信度越高 ;反之 ,难获得候选蛋白 。结果 表明 :质谱准确度和分析条件对蛋白质数据库搜索影响显著 。 关键词 基质辅助激光解析飞行时间质谱 ,肽质量指纹谱 ,蛋白质数据库 1 引 言 基质辅助激光解析飞行时间质谱 (MALD I2TO F2M S)的离子化是一种由基质介导的 、复杂的固相 /气 相过程 ,分析条件的选择对后续蛋白质搜索结果的影响十分明显 ,提高实验结果的准确度 ,给搜索结果 带来高可信度 。基质和质谱分析参数的选择是影响分析结果的主要因素 。因此 ,要获得正确的 PM F必 须高度重视质谱分析条件的选择与优化 [ 1 , 2 ] 。本研究选择蛋白质组分析中最为常用的基质 α2腈 24 2羟基 肉桂酸 ( CHCA ) ,以牛血清白蛋白为标准 ,考察了 MALD I2TO F2M S的主要分析条件和质谱数据准确度对 蛋白质搜索结果的影响 。 2 实验部分 2. 1 试剂与仪器 Ca lib ra tion M ix2 基质辅助激光解析飞行时间质谱仪 (美国 AB I公司 ) ; PR PTEAN Ⅱ X i Ce ll电泳系 统 (美国 B io2R ad公司 ) 。 牛血清白蛋白 (B SA , MW = 69 kD , p I 5. 8 ,大连 TaKaR a公司 ) ; 质谱用胰酶 V 5280 (美国 P rom ega公 司 ) ;考马斯亮蓝 R 2250; NH4 HCO3 , N a2 S2 O3 ,色谱纯三氟乙酸 ( TFA ) ,测序级 α2腈 242羟基肉桂酸 ( CHCA , 美国 Sigm a公司 ) ;色谱纯无水乙腈 (江苏汉邦科技有限公司 ) ;超纯水经 M illipo re纯水系统处理 。 2. 2 实验条件 2. 2. 1 标准 BSA 肽段前处理 将标准 B SA 经 SD S2PA GE ( 12 % )分离纯化后 ,用考马斯亮蓝 R 2250 染 色 ,对 MW = 69 kD 处凝胶精确切取 。样品按下列步骤处理 : ( 1 )脱色 将胶块放入 1 mL 硅烷化 EP管 中 ,先用超纯水涡洗 1 m in ×3 次 ; 接着在 37 ℃水浴中用 200 μL 100 mmo l /L NH4 HCO3 /50 % CH3 CN 2008 206 223 收稿 ; 2008 208 217 接受 本文系国家自然科学基金资助项目 (No.)和教育部博士点基金 (No. 教特发中心函【2004 】166 号 )资助项目 E2m a il: zongyin@ sohu. com 研 究 报 告 ( 1 ∶1 , V /V )溶液脱色 45 m in ×2 次 ,直至完全褪色 ;水洗 3 遍至透明 ;用 5倍胶块体积 CH3 CN 脱水 3 次 , 弃去 CH3 CN , 最后将 EP管