新代DNA测序技术总览.doc

侯总吐血推荐: 新一代DNA测序技术总览 By华大基因生物谷2011年12月07日 13:37:16 作者：尹银亮、陈会平、毛良伟 译 来源：生物谷 原文刊登于《分析化学》综述 Analytical Chemistry原文标题：Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies索引信息：/10.1021/ac2010857 | Anal. Chem. 2011, 83, 4327–4341原文作者：Thomas P. Niedringhaus, Denitsa Milanova, Matthew B. Kerby, Michael P. Snyder,and Annelise E. Barro译者资料：尹银亮，香港华大基因研发中心有限公司 email：stevenyinbio@ 陈会平，毛良伟，武汉华大基因科技有限公司 【内容】 第二代测序 第二代测序成本 第三代测序技术 单分子测序法 边连接边测序法 边合成边测序法 纳 米孔测序技术 蛋白质纳 米孔测序法 固态纳 米孔测序法 长距离阅读DNA的扩展方法 总结性评论 DNA测序正处在技术上天翻地覆剧变的阵痛之中，其突出特点是，测序通量（测序数据量）的大幅增长，原始数据中每个碱基的测序成本急剧下跌，并伴随着以巨资购买仪器以引进新技术的需求。以前看似高不可攀的奢侈性研究活动（如个人基因组测序，宏基因组学研究，以及对大量重要物种的测序），在短短几年之间，正以急速的步伐而变得越来越切实可行了。本篇综述将集中讨论在第三，第四代测序方法背后的故事：它们所面临的挑战；各种方法的局限性；以及它们带给我们的充满诱惑的前景。 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam） 和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基。其测序方法和历史过程以前已做过详细回顾。后来的四色荧光桑格测序法（每一种荧光代表四种碱基中的一种）被用在自动毛细管电泳测序系统中，此系统由应用生物系统有限公司（Applied Biosystems Inc.）推上市场，后来该公司被整合入生命技术公司(Life Technologies)和贝克曼.考尔特公司(Beckman Coulter inc.)（见表1）。 发表于2001年的第一个人类基因组复合序列就是大体上由细管电泳测序系统来测定完成的，不仅耗资庞大，花费人力无数，而且历时超过十年。尽管发表于2001年的基因组仍然处于有待完善的过程中，但其作为基因组的参照序列而被采用，已成为生命科学转化为实际应用的基础，并继续对研究基因型-表现型的关系发挥着重要作用。从迄今为止发表的(和未发表的）文献报道来看，要对人类复杂疾病进深入的有医疗意义的探讨，非常有必要去获得其他类型的个人基因组数据，如，特定组织mRNA表达概况，mRNA测序，基因调控区域的个性化分析，表观遗传调控的概况，以高质量和大范围的染色体图谱分析来归类重要的染色体删缺，插入和重排等等。为成百上千的单个个人，把他们各自的完整基因组学数据与他们完整复杂的病史对应起来，将带我们进入个体化医学的时代。大规模测序中心正完成新一代的测序仪器的转型，联合基因组研究所（the Joint Genome Institute, JGI）已经淘汰了所有的桑格测序仪。而另一方面，除非小型的第二代测序仪能在清楚读出每个碱基上的成本和测序读长 上胜过毛细管电泳测序系统，毛细管测序系统仍将会大量应用于特定区域测序，如定量基因表达，生物标志物鉴定和生物学途径分析等专向性研究。 第二代测序 关于下一代是什么，或更确切的说，第二代测序技术是什么，已有几篇综述出现了。我们提议，将第二代技术定义为：是同步化三磷酸核苷酸的洗脱方法和同步化的光学检测方法的结合。但这种定义不是很严格。因为有几种算作是第三代测序的实时合成测序的方法，也依赖于光学检测。如太平洋生物科学公司（Pacific Biosciences）的单DNA聚合酶测序法就是突出例子。第二代测序技术靠的是连接测序，或者合成测序，包括焦磷酸测序和可逆性的链终止法。由罗氏（Roche），以鲁米那（Illumina）, 赫利克斯（Helicos）和生命技术公司（Life Technologies）以商业化提供的仪器，以短的连续性的片段序列和测序阅读长度的形式，每周输出数十亿碱基对（Gbp）的DNA序列。 对这种基于合成测序，也就是由一种DNA聚合酶或连接酶主导化学过程的第二代测序方法，关于它们所面临的挑战和它们这些酶学方法的优势，另有一篇综述