DNA测序技术及其应用..ppt

1 引言 DNA序列测定的意义DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。 造福人类的HGP2.第二代测序技术 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。 随着人类基因组计划的完成，后基因组时代，即功能基因组时代已向我们走来。第一代测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了第二代测序，又称下一代测序(next—generation sequencing)的诞生。 第二代测序技术包括：454测序技术、Solexa测序技术和SOLiD测序技术。 过程概述 2.2 Solexa测序技术 2.3 SOLiD技术 测序过程： 表1 三种二代测序技术对比 零级波导的纳米结构 小孔的尺寸低于光的波长，小孔底部形成消逝波，创造很小体积的检测空间 DNA链周围游离的荧光标记dNTP有限，非常快速进出于小孔，稳定的背景荧光信号 荧光标记dNTP被掺入到DNA合成链，其携带的特定荧光会持续一小段时间(荧光光曝) 4.3 基于荧光共振能量转移的即时DNA测序荧光供体DNA聚合酶荧光受体4种dNTP荧光共振能量转移具体过程 优点： 游离的dNTP不发光，只有其掺入到新合成的DNA链时才会发光，极大地降低了背景荧光干扰 此方法不需要用到持续的高能量的激发光照射，因此也能够极大地减少DNA聚合酶的光损伤作用，进一步延长了测序长度。 优点： 直接测RNA序列。既然DNA聚合酶能够即时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以应用于第三代测序平台。 直接测甲基化的DNA序列。SMRT技术也可利用甲基化碱基特有的荧光信号来识别模板DNA中的甲基化修饰，如N6·甲基腺苷、5．甲基胞嘧啶或5一羟甲基胞嘧啶 表2 各种测序技术比较 测序过程： dNTP的3‘羟基被化学方法保护 每轮合成反应只能添加一个碱基 测序过程：GenomeAnalyzer系统需要的样品量低至100ng，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到2×50bp，每次运行后可获得超过20 GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。 小结SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括： 文库准备 扩增 微珠与玻片连接 连接测序 与454测序类似SOLiD系统与454测序系统相比，每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。 连接酶 八聚核苷酸 模板 通用测序引物n超高通量是SOLID系统最突出的特点，目前SOLID 3单次运行可产生50 GB的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。 小结 4. 第三代DNA测序技术第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用, 但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的解决仍存在困难,研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。 单分子测序也就应运而生。2009年12月,中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基因组研究所—浪潮基因组科学联合实验室” 三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术单分子即时DNA测序技术(SMRT) HeliScope单分子测序 基于荧光共振能量转移的即时DNA测序 纳米孔单分子测序技术 第三代测序技术 1、目前一期的读取速度为3bp/ s 2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。 3、它的精度非常高，达到99.9999%。 标记荧光基因 DNA聚合酶作用显微镜下进行荧光探测 零级波导的纳米结构来实现即时观察和背景荧光干扰 4.1 单分子即时DNA测序技术 DNA聚合酶4.2 HeliScope单分子测序优点：采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了第二代测序必须用PCR扩增出数千个拷贝以增加信号亮度的缺陷。 DNA聚合酶 荧光标记的dNTP 产生荧光 CCD记录 发生了碱基延伸反应 平面基板模拟图 能量DNA分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔,利用核酸外切酶的特性来识别出不同的DNA碱基优点：纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。 4.4 纳米孔单分子测序技术 内部：核酸外切酶和环式糊精 由生物分子组