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3、载体两性电解质pH梯度等电聚焦 等电聚焦(isoelectrofocusing, IEF 或EF) 是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 利用该技术分析的对象只限于蛋白质和两性分子，分析的条件是凝胶中有稳定的、连续的和线性的pH梯度。 根据建立pH梯度原理的不同，梯度分为： 载体两性电解质pH梯度（Carrier ampholytes pH gradients） 在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度 固相pH梯度（immobilized pH gradients） 将缓冲基团成为凝胶介质的一部分，分辨率比前者高一个数量级 等电聚焦是依照等电点(isoelectric point, pI. 蛋白质的净电荷为零时的pH值)的不同将蛋白质分子分离，反之，根据蛋白质在pH梯度中的位置可测得该蛋白质的等电点 4、双向电泳 双向电泳广义的定义是将样品进行电泳后，为了不同的目的在其直角方向再进行一次电泳 双向电泳大都是第一向为等电聚焦，第二向为梯度SDS电泳，样品经过电荷和质量两次分离后，可以得到分子的等电点、分子量等信息。 分离的结果不是带，而是点。这是目前所有电泳技术中分辨率最高，信息最多的技术。 双向电泳的原理图 由于双向电泳的高分辨率，分离的斑点无法用肉眼来比较和辨别，应用凝胶扫描或摄录系统将数据进行处理。 电泳结果的检测 电泳后的检测，对于不同的目的，应采用不同的检测方法。 用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法： 考玛斯亮蓝染色最为常用，检测灵敏度约为0.2~0.5μg。 银染色，比考玛斯亮蓝染色灵敏100倍，可以检测小至0.38ng/mm2的牛血清白蛋白。银染的机制是将蛋白带上的硝酸银还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。 荧光探针法，也是一种蛋白染色，其特点是染料本身或反应产物必须是发荧光的。但因其保存结果困难且受扫描设备限制的原因，并没有像前两种方法那样被广泛采用。 免疫方法，只要具有单特异性抗体，使用免疫方法检测是比较简便而又具有专一性的方法。最常用的方法是将电泳分离后的蛋白抗原通过电泳印迹，转移到一种膜或滤纸上，然后用合适的抗体进行免疫检测，称为免疫印迹。 三、昆虫碳水化合物 （一）存在部位 昆虫的细胞核、质、膜、肌肉、脂肪体、血淋巴及支持组织中。 （二）功能 是昆虫的重要能量来源 重要的双糖，海藻糖，是昆虫的主要血糖。 重要的多糖，糖元 重要的多糖衍生物，几丁质 ⑴ 糖元是昆虫糖类贮存物的主要形式，贮藏在脂肪体中，在肌肉及其他组织中少贮存。 ⑵ 几丁质是昆虫体最主要的结构组分，是形成內、外表皮、气管、消化道及生殖管道的主要成分。 （三） 碳水化合物的分析方法 1、蒽酮比色测糖法 可用于测定糖元含量，亦可用于测定葡萄糖含量，快速而方便。 原理：蒽酮可以和游离的或多糖中存在的已糖、醛糖及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在光电比色计（分光光度计）620纳米处有最大吸收。 2、糖类的层析法 ⑴纸上层析法 ⑵薄层层析法 ①硅胶G薄层层析 ②聚酰胺薄层层析 四、昆虫的核酸 昆虫细胞中核酸和蛋白质等物质，皆与其他有机物质相结合的状态存在，如DNA与组蛋白等结合, rRNA与核糖体蛋白结合等等。如何提取出这些物质？ （一）?从昆虫材料中提取核酸 昆虫材料（组织或器官） ↓ 10体积0.3N 冷HClO4（过氯酸）匀浆、离心 沉淀用80%酒精，乙醚提洗、离心 沉淀加HClO4，70℃保温20’，离心 得提取液，即核酸提取液 （二）核酸的定量测定法 分光光度法进行比色测定 1、DNA的定量测定—二苯胺法 原理：DNA在有硫酸存在的条件下，同二苯胺（Diphenylamine）起反应，生成糖类的呋喃衍生物，呈显蓝色。 2、苔黑酚法测RNA（改良苔黑酚法） 3、定磷法测定核酸含量 （三）分子生物学 五、色谱分析法 根据分离机理不同，分为： 气相色谱 gas chromatography 是使挥发性物质变成气态后，与载气（即流动相）一起通过装填有固定相的色谱柱而将其分离的技术 液相色谱 liquid chromatography 用液体作流动相（即洗脱液）的色谱法称为液相色谱法 根据固定相的形态，液相色谱分为： 柱色谱法 色谱柱 薄层色谱法 硅胶制成薄层为固定相 纸色谱法 滤纸为固定相 使色谱柱实现高性能化，从流动相的输送到洗脱液的检测实现仪器化的柱色谱法—— 高速（效）液相色谱法（high performance liquid chromatography) 气相色谱法 以气体作流动相，以固体（气固色谱）或液体（气