细胞原代培养细胞生物学实验报告.doc

细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理 细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。 原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法 在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法 将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养 。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。?取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤 1、购买9-12日龄鸡胚蛋。放入孵化箱中孵养待用。 2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。 3、取D-hanks液按1:100加入双抗。 4、换用洁净的无菌镊子揭开膜，再用洁净的无菌弯头镊子取出鸡胚至灭菌的培养皿中，并用D-hanks液冲洗鸡胚三遍。 5、用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-hanks液充分洗涤躯干部分三遍。 6、将洗涤过的躯干移至干净的培养皿，吸去多余的液体，然后用眼科剪将躯干充分剪碎（约四分之一米粒大小）。 7、向碎块中加入一滴管胎牛血清将组织碎块切散，用滴管将组织碎块接入培养瓶中，静置一分钟，再加入5ml完全培养液，将瓶子翻转倒置后在37度培养箱中放置2-3小时，待组织块微干与瓶壁贴牢后再将瓶子翻转过来，于培养箱中培养。 8、将用过的试剂仪器等摆回原处，将超净台打扫干净，关闭照明灯及抽风机。 9、实验后数小时后去观察组织块中细胞迁移情况，并拍摄照片。 五、实验结果 原代培养过夜后第二天中午一点拍照，观察细胞迁移情况，以下是我们小组的实验结果。 鸡胚成纤维细胞原代培养（倒置显微镜20×） 鸡胚成纤维细胞原代培养（倒置显微镜20×） 显微镜下可观察到鸡胚组织块附近有大量细胞迁移。迁移出来的细胞呈纤维状，贴壁生长。实验结果比较理想，细胞迁移较多，大部分细胞活性较好，呈梭形附着与瓶壁上，且没有污染发生。 操作时应注意的问题：要注意无菌操作，实验过程中要保持组织块浸润在缓冲液中，接种组织块到培养瓶中后应组织略干燥，能黏附于瓶壁时使之与培养液接触 六、思考题 1、从细胞增殖及调控角度来看哪种组织和器官适用于原代培养实验？ 取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 2、如何提高原代细胞培养的成功率？ 取材要注意新鲜和保鲜，取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄