《光学显微镜》课件.ppt

*************************************载玻片和盖玻片的使用载玻片规格标准载玻片尺寸通常为76×26mm，厚度约1mm；应选择透明度高、平整度好、厚度均匀的优质载玻片；特殊研究可能需要使用凹槽载玻片、计数载玻片或带荧光的特殊载玻片。盖玻片规格常用盖玻片尺寸为18×18mm或22×22mm，厚度约0.13-0.17mm；厚度等级通常分为0号至3号，高倍观察应选择较薄的0号或1号盖玻片；形状有方形和圆形两种，根据需要选择。制片技巧清洁载玻片和盖玻片，去除油污和灰尘；样品滴加适量液体，避免气泡；盖玻片从一侧轻轻放下，减少气泡形成；多余液体可用吸水纸轻轻吸除；需长期保存的样品可用指甲油或封片剂封边。常见问题气泡：影响观察效果，可尝试重新制片或轻轻加压排出；样品过厚：导致无法对焦，应重新制备更薄的样品；液体过多：造成样品漂移，可吸除多余液体；污染：影响图像质量，应保持制片环境和工具的清洁。染色技术简介1基本原理染色技术利用特定染料选择性地与样品中的特定结构或成分结合，增强这些结构的可见度和对比度。不同的染料具有不同的化学亲和性，可以特异性地显示不同的细胞结构或物质。2常用染色方法苏木精-伊红染色(HE)：组织学标准染色，显示细胞核和细胞质；瑞氏染色：血液细胞分析；革兰氏染色：细菌分类；姬姆萨染色：寄生虫和染色体观察；荧光染色：特定分子标记和活细胞研究。3染色步骤一般包括固定、去石蜡（如需）、染色液处理、分化、脱水、透明和封片等步骤。具体流程根据染色方法和样品类型有所不同，需要按照标准操作程序进行。4选择考虑染色方法的选择应基于研究目的、样品类型和需要观察的结构。需考虑染色的特异性、持久性、与其他检测方法的兼容性以及可能的人工因素影响。明场显微镜技术1原理明场显微镜是最基本的显微镜类型，利用样品对光的吸收、反射和散射产生对比度。光源发出的光线通过聚光镜照射样品，被样品吸收或散射后进入物镜，形成明亮背景上的暗色图像。2适用样品明场显微镜适合观察有色或染色过的样品，如染色的组织切片、血液涂片、固定的微生物等。对于透明或低对比度的样品，如活细胞或无色细菌，明场技术的效果相对有限。3优势操作简单，设备成本低；图像直观，颜色真实；适合教学和常规检查；与大多数染色技术兼容；可观察样品的形态和颜色特征。4局限性对无色透明样品的对比度低；分辨率受衍射限制；对细微结构的显示能力有限；对活细胞观察不理想；深色样品细节可能被掩盖。暗场显微镜技术光路原理暗场显微镜使用特殊的暗场聚光镜，中心有遮光装置，只允许高角度光线照射样品。这些光线被样品散射后进入物镜，而未被散射的光线则无法进入物镜，形成明亮物体在黑暗背景上的图像。适用样品暗场技术特别适合观察活的、未染色的透明样品，如细菌、原生生物、血细胞等。它能显示肉眼和明场下难以看到的细微结构，如细菌的鞭毛、螺旋体的运动等。应用优势大幅提高透明样品的对比度；无需染色，可观察活体样品；能显示明场下不可见的微小结构；特别适合观察微生物的运动；在珠宝学和材料科学中用于表面缺陷检测。暗场显微镜技术虽有诸多优点，但也存在一些局限性：图像中显示的主要是样品的轮廓而非内部结构；光线利用效率低，需要更强的光源；容易产生散射伪影；不适合观察密集或厚的样品；高倍率观察需要特殊的暗场物镜或暗场片。相差显微镜技术工作原理相差显微镜利用光波通过不同折射率介质时产生的相位差来增强对比度。特殊设计的相位板（位于物镜内）将直接光和散射光之间的相位差转换为振幅差（亮度差），使透明结构变得可见。系统组成相差显微镜包括标准光学显微镜基础上的特殊部件：相差聚光镜（带有相位环）和相差物镜（内含相位板）。聚光镜中的相位环必须与物镜中的相位板精确对准才能获得最佳效果。适用范围相差显微镜特别适合观察活的、未染色的透明样品，如培养细胞、组织培养、微生物等。它能显示明场显微镜下难以区分的细胞内结构，如细胞核、细胞器、包涵体等。临床应用在生物医学研究中，相差显微镜被广泛用于细胞培养观察、微生物活动研究、精子活力分析等。它允许在不破坏样品活性的情况下观察细胞内部结构和动态变化。荧光显微镜技术基本原理荧光显微镜利用特定物质被特定波长光激发后发出较长波长荧光的特性。专用滤光系统分离激发光和发射光，使荧光信号在黑暗背景上清晰可见。这种技术能够特异性地标记和观察特定分子或结构。系统组成荧光显微镜包括高强度光源（汞灯、氙灯或LED）、激发滤光片（选择特定波长光）、二向色镜（反射激发光、透过发射光）、发射滤光片（只允许荧光通过）和高灵敏度检测系统。染料选择常用荧光染料