SN_T 1616-2013非洲木薯花叶病毒检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1616—2013代替SN/T1616—2005非洲木薯花叶病毒检测方法Detection of African cassava mosaic virus2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准非洲木薯花叶病毒检测方法SN/T1616--2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013)北京市西城区三里河北街16号（100015）总编室：(010址中国标准出版社案皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张1字数26千字2014年2月第一版2014年2月第一次印刷印数1--1600*书号：155066·2-26553 SN/T 1616-2013前 言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1616一2005《非洲木薯花叶病毒检测方法》。本标准与SN/T1616一2005相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：一增加了常规PCR检测方法；一增加了实时荧光PCR检测方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李明福、冯黎霞、洁、张永江、孔君、李桂芬、相宁、魏梅生、张成良。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1616—2005。 SN/T1616-2013非洲木薯花叶病毒检测方法1范围本标准规定了非洲木薯花叶病毒检测鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能带有非洲木薯花叶病毒的所有进境木薯及苗木等的检疫检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3非洲木薯花叶病毒基本信息学名：Africancassavamosaicvirus。缩写：ACMV。分类地位：双生病毒科（Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。传播途径：主要通过木薯粉虱（Bemisiatabaci）种薯及块茎等传播。非洲木薯花叶病毒的其他信息参见附录A。4方法原理根据ACMV在鉴别寄主上的症状进行生物学检测；根据ACMV与抗体之间的特异性反应，对样品进行酶联免疫吸附检测；根据ACMV的粒体特性进行免疫电镜观察；根据ACMV核酸保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定。5仪器设备、用具及试剂5.1仪器设备透射式电子显微镜、酶联检测仪、电子天平、水浴锅、PCR扩增仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、台式高速冷冻离心机和凝胶成像系统等。5.2用具可调移液器、移液器头、酶联板、离心管和研钵等。5.3试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。检测试剂见附录B、附录C、附录D。 SN/T1616—2013实验室检测6木薯种于隔离温室中，待长出苗后取叶片做血清学检测；木薯试管苗及脱毒苗则直接对植株进行血清学检测（见附录B)。血清学检测结果为阳性的再用生物学测定（见附录C)或免疫电镜观察（SN/T1840)或常规PCR检测（见附录D)或实时荧光PCR检测（见附录E)中的一种方法进行复查。7结果判定检测结果符合以下五种方法结果中的两种，即可判定样品为非洲木蒋花叶病毒阳性：通过免疫电镜从样品中观察到的病毒粒体与A.5描述的相同；样品血清学检测为阳性；一生物学测定鉴别寄主反应与C.3描述相吻合；常规PCR检测为阳性；-实时荧光PCR检测为阳性。8样品保存与复核8.1样品保存木薯繁殖材料样品妥善保存于4℃冰箱中，试管苗保存于组培室中，以备复核。8.2复核完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、采样时间、实验的时间、地点、方法和结果等.并要有经手人和实验人员的签字。生物学鉴定需有鉴别寄主的症状照片，电镜观察需有病毒粒体照片，血清学检测需有酶联板反应的照片，常规PCR检测需有电泳图片，实时荧光PCR检测需有扩增曲线图片。2 SN/T-1616—2013附录A（资料性附录）非洲木薯花叶病毒背景资料A.1寄主范围自然寄主包括木薯（Manihotesculenta）、猪菜藤（Hewittiasublobata）、西阿拉橡胶树（Manihotglaziouii）及火焰桑叶麻（Laporteaaestuans），人工接种可侵染瓜类及烟类等多种植物A.2病害症状木薯植株不同生长时期都可以被侵染致病，幼龄植株更易感染，典型症状为系统花叶。感病植株首先在叶片上呈褪绿小斑，逐步扩大，褪绿斑愈合与正常绿色形成花叶。有时受侵叶片背面可