《黄瓜绿斑驳花叶病毒检测鉴定方法》编制说明 1 基本信息 11 标准 .doc

《黄瓜绿斑驳花叶病毒检测鉴定方法》编制说明 1 基本信息 1.1 标准草案名称 中文 黄瓜绿斑驳花叶病毒检测鉴定方法 英文 Detection and identification of Cucumber green mottle mosaic virus 1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况 等同 修改 非等效√ 标准号 英文名称 中文名称 1.3 任务来源 批准立项的文件名称和文件号 《关于下达2011年出入境检验检疫行业标准制(修)订计划项目的通知》（国认科函[2011]54号） 计划编号 2011B218 1.4 制（修）订情况 制定 修订 替代的标准编号 SN/T 2344-2009 1.5 起止时间 2011年4月～2012年12月 1.6 起草单位 厦门出入境检验检疫局、北京出入境检验检疫局 1.7 起草人 陈 青、、廖富荣、陈红运、林石明10501.59 1.10 调整情况 2 背景情况 2.1 目的、意义 自2005年以来，黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV）在我国辽宁、河北、北京等地造成严重经济损失，重病区甚至绝收。CGMMV的传入引起了我国口岸检疫部门和农业主管部门的高度重视，为此农业部发布了第788号公告，根据《植物检疫条例》 有关规定，将其确定为全国农业植物检疫性有害生物。 CGMMV可通过机械接触传播和种子传播，而且该病毒极其稳定，一旦发生就很难根除。在黄瓜(Cucumis sativus)上新叶出现黄色小斑点，后出现花叶并带有浓绿色突起，叶片上出现色斑，水泡及变形，叶脉间褪色呈叶脉绿带状产生的典型症状植株矮化，产量损失达15%受感染的果实通常没有症状，但有些株系能够使果实导致严重的色斑和变形，有些亚洲株系在叶片上并不出现症状但是却能造成产量下降；在西瓜上(Citrullus vulgaris)叶片只产生轻微的斑纹和矮化茎端幼叶出现淡黄色花叶，其后出现浓绿凹凸斑，随叶片老化症状减轻果实表面有浓绿圆斑，中央有坏死点，种子周围的果肉呈赤紫色水浸状，成熟时变为暗褐色，出现空洞造成严重的变色或使果实内部造成腐烂甜瓜：茎端新叶出现黄斑，但随叶片老化症状减轻瓠瓜：叶片出现花叶，有绿色突起，脉向黄化呈叶脉绿带状。本项目建立花叶病毒的血清学、分子生物学检测鉴定方法。其中，拟采用的 DAS-ELISA血清学方法，已购置检测抗体进行可靠性验证，并用于田间采集样品的检测筛选；拟采用的RT-PCR分子生物学方法，为本科技项目所研究建立的方法，并已在相关实验室中推广应用。本项目的实施，一方面，本标准的制定实施，对控制该病毒的危害，保护我国葫芦科作物的安全生产具有十分重要的意义；另一方面，本标准的制定实施，对促进我国进出口贸易的良性发展也具有十分重要的意义。TrizoL提取法和纳米磁珠法提取植物总RNA； cDNA合成； PCR条件优化，灵敏度检测。 3. 快速免疫免疫层析实验 4.电子显微镜实验 3.2 分工情况 陈 青，厦门出入境检验检疫局，组织标准的调研和起草。 邓丛良，北京出入境检验检疫局，参加标准的调研和起草。 黄峰，厦门出入境检验检疫局，参加标准的调研和起草。 廖富荣，厦门出入境检验检疫局，参加标准的调研和起草。 陈红运，厦门出入境检验检疫局，参加标准的调研和起草。 林石明，厦门出入境检验检疫局，参加标准的调研和起草。 3.3 标准草案编写情况 完成征求意见稿。 3.4 征求意见情况（适用于送审稿） 3.5 审定情况 （适用于报批稿） 3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准） 参照国内外最新的研究成果，预期达到国内先进水平。将该标准用于口岸植物检疫一线，使具有专业基础的技术人员基本能够做到准确鉴定，具有明显的经济效益和社会效益。 4 主要技术内容的确定 1. RT-PCR方法的建立 1.1 引物设计与合成 设计了一对特异性引物，扩增部分的外壳蛋白（apsid protein， CP）基因序列，预计长度为 bp。 1.2. 病叶总RNA的提取 含有花叶病毒（MV）的病叶由，总RNA的提取使用TRIzol Reagent方法。 1.3. cDNA合成 利用反转录酶合成cDNA作为后续PCR的模板。 1.4. PCR条件优化 最终确定的反应程序为：95 ℃预变性min，然后94 ℃变性30 s、60℃退火 s、72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后延伸7 min。根据优化后的反应条件，对病叶进行RT-PCR扩增，结果表明在感染MV的西葫芦病叶中扩增到约6 bp的条带。. DAS-ELISA方法验证 购置抗体，对DAS-ELISA方法进