DB32T 3487-2018 黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程　.docx

ICS65.020.20B16

备案号：60524-2018

江苏

省

地

DB32

方标准

DB32/T3487—2018

黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程

TechnicalSpecificationfortheSeedlingDetectionofCucumberGreenMottleMosaicVirus

2018-11-09发布2018-11-30实施

江苏省质量技术监督局发布

DB32/T3487—2018

I

前言

本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构及编写》的规定编写。

本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准主要起草人：程兆榜、任春梅、季英华、杨柳、缪倩、周益军。

DB32/T3487—2018

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黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程

1范围

本标准规定了苗床期瓜苗黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测条件、检测技术、结果判定和结果记载。本标准适用于苗床期症状尚未表现的瓜类作物上黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的的修改单）适用于本文件。

GB/T35335黄瓜绿斑驳花叶病毒病监测规范SN/T2964植物病毒检测规范

3检测条件

3.1主要试剂

磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钾（KCl）、氢氧化钠（NaOH）、碳酸氢二钠（Na2HCO3）、氯化钠（NaCl）、叠氮化钠（NaN3）、PVP-400、鸡卵清蛋白、无水亚硫酸钠（Na2SO3）、吐温-20、焦碳酸二乙酯（DEPC）、溴百里酚蓝、乙二醇、Tris碱、Tris-HCl、硼酸、EDTA、无水乙醇、琼脂糖、DIGDNALabelingKit、CGMMV抗体。PCR试剂和检测过程中所需溶液配方，参见附录A。除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。

3.2用具及仪器

用具耗材：移液器、一次性手套、牛皮纸袋、标签纸、记号笔等

仪器设备：高压灭菌锅、培养箱、高速冷冻离心机（规格：-6℃~20℃、最高转速12000转/分以上）、电泳仪（规格：电压50~120V、电流10~800mA）、PCR仪、凝胶成像系统、超纯水仪。

4检测技术

4.1采样方法

4.1.1采样时间

待检材料为嫁接或未嫁接的黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等瓜类作物幼苗，采样时间为出厂定植前3天~7天植株处于2片~4片真叶期。

4.1.2采样部位

植株最上部半展开-展开的心叶，心叶未达要求时取位于心叶下部一张完全展开叶。

4.1.3取样方法

五点法取样，一株为一个样本，不同品种或同一品种不同时间播种的为不同批次，每批次样本数量不小于200株或同批次苗的0.1%。样本采集时使用一次性手套单株采集并临时保存在一次性手套中。

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4.1.4样品处置

取样后叶片一分为二，一半为检测样品、一半为留存样品。样品用吸水纸包裹置于透气牛皮纸袋中，新鲜检测样品在4℃下临时保存3天内检测完毕，如不能在3天内检测则将样品于-20℃的条件下冰冻保存。留存样品室温下荫干-20℃的条件下冰冻保存一年后，确认不再需要时焚烧或深埋处置。

4.2检测方法

4.2.1样品处理

称取0.1g待检样品叶片，加入适量液氮充分研磨成粉末后加入10倍体积的通用样品处理缓冲液（见附录A）溶解，10000转/分离心5分钟，上清即为样品提取液。同一批样品中加入具典型斑驳花叶症状并经PCR法鉴定确认为CGMMV的病样稀释1000倍为阳性对照、经PCR法确认无CGMMV的健康叶片为阴性对照。

4.2.2免疫捕获

4.2.2.1用碳酸盐包被缓冲液（见附录A）稀释黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗血清500倍，取稀释后的抗血清30μL包被PCR管，4℃孵育过夜或37℃下放置2h。

4.2.2.2弃包被缓冲液，用洗涤缓冲液（见附录A）洗涤3次~4次，加入50μL样品提取液，37℃孵育2h。

4.2.2.3弃样品提取液，用洗涤缓冲液洗涤3次~4次，再用无菌去离子水洗一次，吸尽管底余液后直接在包被了病毒的PCR管中进行反转录。

4.2.3反转录

4.2.3.1CGMMV特异性引物的设计及合成根据CGM