SN_T 3438-2012南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3438-2012南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of southern bean mosaic virus2013-07-01 实施2012-12-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局30封涂层查真药， 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法SN/T 3438—2012中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 www. spc. net. cn中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230 1/16印张 0.75 字数 18 千字2013年6月第一版反　2013年6月第一次印刷印数 1—1 600*书号：155066·2-25288 SN/T 3438-2012前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局，本标准主要起草人：陈青、陈岩、李、刘忠梅、陈红运、廖富荣、林石明I SN/T 3438—2012南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法1. 范围本标准规定了南方菜豆花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法，本标准适用于可能携带南方菜豆花叶病毒的豆科种子的检疫鉴定。2原理南方菜豆花叶病毒（southern beanr-mosaic-virus,SBMV）为南方菜豆花叶病毒属（sobemovirus）的典型成员。抗原特性和基因组特征(参见附录 A)是检疫鉴定的主要依据。3仪器、设施及试剂3.1仪器与设施酶联检测仪、电子天平（感量0.0bo1g）、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等;微量移液器（2.5μL,10μL,20μL,100μL,200μL，1000μL)；酶联板、研钵等；防虫温室。3.2试剂酶联检测试剂（见附录B),RT-PCR检测试剂见附录C)。4检疫与鉴定4.1制样挑取畸形、不成熟的种子播于灭菌土中，待长出3～4片真叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的吐片分成两份，分别用于酶联检测和分子生物学检测。4.2检测4.2.1双抗体夹心酶联免疫吸附检测把制备的样品上清液加人已包被 SBMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染SBMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如：种子或叶片)应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。4. 2.2RT-PCR 检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染SBMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。1 SN/T 3438—2012具体操作见附录 C。5 结果判定酶联检测阳性，使用 SBMV特异性引物进行RT-PCR检测，扩增出目的条带，判定样品是携带SBMV,否则不携带。样品酶联检测阳性，使用SBMV特异性引物未扩增出目的条带，可用南方豇豆花叶病毒的特异引物对该样品进行RT-PCR检测（参见附录A）。6样品保存、结果记录与资料保存6.1样品保存经检测确定携带SBMV的样品应在合适条件下保存，种子保存在4℃，病叶冻干保存在一20℃或者一80℃冰箱中，做好标记和登记工作。6.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片。2 SN/T 3438--2012附录A（资料性附录）南方菜豆花叶病毒简介A.1分类信息学名: southern bean mosaic virus缩写:SBMV分类地位：南方菜豆花叶病毒属（sobemovirus）SBMV是南方菜豆花叶病毒属的典型成员，与同属的南方豇豆花叶病毒（southern cowpea mosaicvirus,SCPMV)在基因组结构、病毒粒子稳定性和抗原特性等方面极为相似，SCPMV一度被划分为SBMV 的 C株系，直至病毒基因组全序列测定后,才将两者准确区分。A.2 主要寄主菜豆（Phaseolus vulgaris）、大豆(Glycine max）、黑绿豆(Vigna mungo）、绿豆(Vigna radiata）、豇豆(Vigna sinen