GB/T 31805-2015豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

ICS 65.020.01 ,____ 中华人民共和 国 国彖标准 GB/T 31805—2015 莊豆重花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Cowpea severe mosaic virus 2015-07-03 发布 2015-1 1-27 实施 幅畿勰畫曹1警彎畫发布 GB/T 31805—2015 -—1— 刖 旨 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识別这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、 中华人民共和国江苏出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：陈青、李彬、方志鹏、黄峰、廖富 、陈红运、林石明。 GB/T 31805—2015 卽豆重花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了貳豆重花叶病毒检疫鉴定的血清学、 生物学和分子检测方法。 本标准适用于可能携带有臥豆重花叶病毒的植物繁殖材料（种子、植株）和产品的检疫鉴定。 2仪器设备和主要试剂 2.1仪器设备 PCR仪、定量PCR仪、灭菌锅、制冰机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、 电泳仪、凝胶成像系 统、微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001 g）、水平电泳槽、高速冷冻台式离心机、水浴槽、 pH计、移液器 （1 000卩L、200 piL、20卩L、2 ML）,96孔酶标板、研钵等；防虫温室。 2.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、dNTPs dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、DNA 聚合酶、引物和探针、琼脂，酶联检测试剂见附录B。 3检测样品的制备 3.1种子 挑取畸形种子播于灭菌土中，待长出3片〜4片叶后，将表现症状的植株编号，未表现症状的植株 分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成2份,根据需要分别用于酶联测定和分子检测。 3.2 植株 有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的植株编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法 和检测方法同3.10双抗体夹心酶联免疫吸附测定。 4检测与鉴定 4.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定 把制备的样品上清液加入已包被CPSMV抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA。每个样品平行加到 两个孔中。设阴性对照和阳性对照［健康的植物组织作阴性对照，感染了 CPSMV的植物组织作阳性对 照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致:］，样品提取缓冲液作空白对照，不 同的检测试剂或试剂盒按说明操作。具体操作见附录B。 4.2 RT-PCR 分別提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对 照，感染CPSMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录Co 1 GB/T 31805—2015 4.3 IC-RT Real-time PCR 分別提取样品和对照的总RNA,进行IC-RT real-time PCR检测。健康的植物组织作阴性对照，感 染CPSMV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录D。 4. 生物学测定 样品按1 : 2 — 1 : 10（质量：体积）加入研磨缓冲液，在研