课堂新坐标2016_2017学年高中生物第1章微生物培养技术第3节测定微生物的数量教案.doc

第三节测定微生物的数量 一、测定微生物数量的方法 测定微生物数量的方法可分为两类：直接计数法和间接计数法。前者常用的是显微镜直接计数法，这种方法是先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。该方法适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。后者最常用的是稀释平板计数法，需要将待测样品配制成均匀的系列稀释液并使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后统计培养基中出现的菌落数，从而推算出样品中的活菌数。 利用血球计数板测出的菌体数与平板计数法相比哪个多些？ 【提示】　血球计数板测出的是全部菌体数，而平板计数法只能测出活菌数，而且比实际数偏少。 二、间接计数法的实验设计 1．制备土壤稀释液 取土壤表层5～10 cm处的土样。准确称取1 g土样，放入盛有99 mL无菌水的锥形瓶中，振荡20 min后制成102倍的稀释液。然后进行系列稀释，得到103、104、105、106倍的系列稀释菌液。 2．取样及倒平板 3．培养 4．观察记录 (1)计数时对于细菌、放线菌以每个培养皿内有30～300个菌落为宜，霉菌以每个培养皿内有10～100个菌落为宜。 (2)计算每克样品菌数公式为：每克土壤样品菌数＝×稀释倍数。 预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中 问题1 问题2 问题3 问题4 一、微生物生长量的测定 1.测重量法 干重法：将单位体积待测的培养液离心后，用清水洗涤1～5次，放入干燥器中加热干燥，加热温度一般在100～105 ℃之间，再称重。以细菌为例，一个细胞一般重约10－12～10－13g，也可在较低温度(如40 ℃)下进行真空干燥。 湿重法：将一定量的菌悬液离心或过滤，得到菌体，反复洗涤后称湿重，干重一般为湿重的20%～25%。 2．计数法 (1)直接计数法 这种方法是利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成。 将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×1 000×稀释倍数 (2)间接计数法(活菌计数法) 稀释平板涂布法，常用来统计样品中的活菌数。此法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时先将待测样品做一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿上，使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。 说明：①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板上进行计数。 ②将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放入适宜的温度下培养计算菌落数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布、培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 ④涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。 二、测定土壤中的微生物数量 土壤中生活的微生物种类和数量是极其丰富的，这些数量众多的微生物对提高土壤肥力有重要作用。因此，测定土壤的含菌量可以作为判定土壤肥力的一个重要指标。 1．实验原理 平板菌落计数法是将待测定的微生物样品按比例作一系列稀释后，将其中的微生物充分分散成单个细胞，吸取一定量某几个稀释度的菌液接种到平板上，培养一段时间后，每个单细胞生长繁殖形成单个菌落，根据稀释倍数、取样接种量和菌落数即可换算出样品的含菌数。 2．材料用具 土壤样品：尿素，酵母粉，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠、酚红、琼脂，1 mol/L NaOH溶液，无菌吸管，盛有9 mL无菌水的试管，盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶，试管架，无菌培养皿，记号笔，烧杯等。 3．方法步骤 (1)制备尿素固体培养基 准确称取尿素20 g，酵母粉0.1 g，磷酸二氢钾9.1 g，磷酸氢二钠9.5 g，酚红0.01