专题5-课题3-血红蛋白的提取和分离-课件.ppt

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 讨论： 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 实验操作 （二）凝胶色谱操作 课题 3 血红蛋白的提取和分离 蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分负责血液中O2和CO2的运偷。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材抖，学习蛋白质提取和分离的一些基本才技术 课题背景 根据蛋白质各种特性的差异， 如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 基础知识 1、凝胶色谱法：分配色谱法 根据蛋白质相对分子质量的大小，利用具有多孔结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离蛋白质的方法。 2、凝胶 ①性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通道； ②化学本质：多糖类化合物： ③实例：葡聚糖、琼脂糖： 5、具体过程 基础知识　　（一） 凝胶色谱法 原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 1、缓冲溶液概念、作用 在一定的范围内，能抵制外界酸或碱对溶液PH的影响，维持其PH值基本不变，具有这样缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 2、缓冲溶液配制 通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 基础知识　 （二）缓冲溶液 ①弱酸和弱酸盐组合 H2CO3/NaHCO3 CH3COOH/CH3COONa 3、缓冲溶液的组分分类 ②弱碱和弱碱盐 ③多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐 NH4OH /NH4CI NaH2PO4 /Na2HPO4 KH2PO4 /K2HPO4 该课题使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)。 2、原理：许多重要的生物大分子，（ ）等都具有( ) 在( )下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。 多肽、核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 一定的PH 基础知识　　　　（三）电泳 1、概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3、电泳的类型 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质分子量。 ①应用 ②聚丙烯酰胺凝胶 　　蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。 ③原理 4、实例　 ④ SDS作用 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS。 SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 ⑤ SDS作用机理 讨论：如何测定蛋白质的分子量？ 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。（市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售） 实验操作 （一）样品处理 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 问：蛋白质提取和分离步骤？ 血液 血 浆 水分 固体物质 血浆蛋白 无机盐 磷脂