精氨酸激酶的课件资料.pptx

精氨酸激酶的课件资料;目录;蛋白质的分离纯化;▲目标蛋白质的分离纯化程序主要包括: ⑴材料的选择； ⑵组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； ⑶蛋白质初步提纯； ⑷选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全 纯化； ⑸目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。 ;一、蛋白质是两性电解质 根据蛋白质的分子结构，很容易得出构成蛋白质的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的基团。 作为两性电解质，每种蛋白质都有其等电点(pI) ，这与它所含的氨基酸种类和数量有关。 所有的蛋白质，不管它具有什么样的功能，都能在细胞内起一定的缓冲作用。 ?;1. 蛋白质的电泳分离 凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用于蛋白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成，其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性电泳和变性电泳。 ;1 透析 2 层析原理 3 凝胶过滤 4 离子交换层析 5 亲和层析 6 电泳;1 透 析; 层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。 层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。; 将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。 然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。 样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成分分离的目的。; 凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。;带网孔的葡聚??珠;凝胶过滤层析过程示意图;蛋白质Mr=49,000; 如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。 离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 带有SO3－ 或COO－基团，通常以SO3－Na＋ 或COO－H＋形式出现的叫做阳离子交换基； 带有N＋（C2H5）基团通常以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做阴离子交换基。;阳离子交换基;阴离子交换基;时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。 当pI pH时，蛋白质带净负电荷；而当 pI pH时，蛋白质带净正电荷。;阳离子交换层析过程; 依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。 当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。;;亲和层析过程; his- tag所用层析凝胶的基质上连接了一个NTA（[=nitrilotriacetic acid]氮基三乙酸），可以与Ni离子结合，而Ni离子与融合蛋白的6Xhis氨基酸之间产生如图的吸引力，从而将带有his-tag组氨酸标签的融合 蛋白与其它蛋白区分开来。从图中可以看到，组氨酸残基红色五元咪唑环是蛋白与Ni离子作用的关键。因此带暴露的His-6的蛋白能结合于固化Ni树脂，用适当缓冲溶液冲洗去其他蛋白后，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可以回收靶蛋白。;电泳;电泳技术分类;SDS－PAGE测定相对分子质量;;第28页/共42页;第29页/共42页;第30页/共42页;研究背景;主要实验仪器 紫外分光光度计U－4300，电脑恒温层析柜、 ORION pH计、 紫外检测仪、冷冻离心机、 超声破壁仪 、雪山制冰机、 超纯水机、低温恒温槽电泳仪、电子天平、振荡培养箱、 单人单面净化工作台、电热恒温鼓风干燥箱