生化实验论文-转基因产品检测 核酸提取纯化.doc

《生化实验技术与应用》 综合设计性实验 实验论文 实验名称： 班级组别： 学 号： 姓 名： 指导教师： 完成日期： 大豆基因组DNA的提取与分离鉴定摘要：DNA。同时掌握提取植物组织基因组DNA的基本方法、紫外分光光度法测定DNA含量的原理和方法、DNA的水平式琼脂糖凝胶电泳操作、高速冷冻离心机等仪器设备的使用。 关键词：DNA；提取鉴定PCR；琼脂糖凝胶电泳1 前言核酸是生物有机物体重的重要组成成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起。核酸分为DNA和RNA两大类，前者主要存在于细胞核内，后者要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA则溶于上层水相。将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA的少量溶解。95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可以除一些盐分，经Rnase解RNA，可得较纯的DNA。DNA含量与纯度测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm有吸收峰，根据公式[DNA(μg/mL)=A260*50*稀释倍数可计算出核酸DNA的浓度。由于蛋白质在280nm有吸收峰，可根据比值判断DNA纯度：A260／A280＜1.8时，表明蛋白质含量偏高；1.8＜A260／A280＜1.9时，表明样品较纯；A260／A280＞2.0时，表明RNA或DNA碎片较多。 DNA的原理为：在强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，产生嘌呤碱基、脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中，2’-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA含量成正比。 在转基因技术中，外源基因导入到植物体中时，通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子启动下游编码基因的转录。在染色体中，一个转录单位由启动子序列，编码序列和终止序列组成，常用终止序列是胭脂碱合酶（NOS）CaMV35S启动子或NOS终止子序列进行分析，即可定性分析植株体是否为转基因品种。本文以上述所提取出的大豆基因组为模板，采用PCR技术（聚合酶链式反应）大量扩增CaMV35S启动子序列，同时采用大豆品种特异性基因Lectin作为内参基因，可对所提取的基因组进行质量评价。经过琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物片段大小，若成功扩增得到CaMV35S启动子序列，其大小应该是195bp，而Lectin片段大小为118bp。结合此实验结果，可初步对所研究大豆品种是否含有转基因成分。预进一步对结果进行确证，可通过其他辅助证据加以证明，如对PCR扩增产物进行限制性内切酶分析，测序分析，结合可溯源的阳性对照品种等试验结果等。 电泳是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。 不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB）254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。 2 材料与方法 2.1 材料与设备2.1.1 实验材料2.1.2 试剂及配制方法基因组DNA的提取和纯化 1.淀粉酶（可选），1500单位/mg-3000单位/mg蛋白质 2.三氯甲烷（CHCl3） 3.98%乙醇（C2H5OH） 4.乙二胺四乙酸二钠盐 Na2EDTA（C10H14N2O8Na2） 5.CTAB（C19H42BrN） 6.37%盐酸（HCl） 7.异丙醇（CH3CHOHCH3） 8.蛋白酶K（可选），冷冻状态下约50单位/mg 9.RNA酶（可选），不含DNA酶，冷冻状态下约50单位/mg 10.氯化钠（NaCl） 11.氢氧化钠（NaOH） 12.TRIS（C4H11NO3） 13.淀粉酶溶液（可选）淀粉酶10mg/ML，不要灭菌。-20摄氏度保存，避免反复冻融 14.CTAB-1提取缓冲液（PH8.0） 称取4.00gCTAB，16.38g氯化钠，2.42gTRIS，1.50gNa2EDTA，4.00gPVP-40，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。临用前按使用量加入巯基乙醇，使其终浓度为2%。 15.CTAB-2提取缓冲液（PH8.0） 称取4.00gCTAB，16.38g氯化钠，2.42gTRIS，1.50gNa2EDTA，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。 16.CTAB沉淀