real-time PCR(中文).ppt

It should also be noted that samples that differ by a factor of 2 in the original concentration of cDNA (derived from mRNA) would be expected to be 1 cycle apart. Thus samples that differ by a factor of 10 (as in our dilution series) would be ~3.3 cycles apart. It should also be noted that samples that differ by a factor of 2 in the original concentration of cDNA (derived from mRNA) would be expected to be 1 cycle apart. Thus samples that differ by a factor of 10 (as in our dilution series) would be ~3.3 cycles apart. It should also be noted that samples that differ by a factor of 2 in the original concentration of cDNA (derived from mRNA) would be expected to be 1 cycle apart. Thus samples that differ by a factor of 10 (as in our dilution series) would be ~3.3 cycles apart. 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR) 实时定量PCR的原理 实时定量PCR在生物学研究中的应用 实时定量PCR的实验建立 提要 实时定量PCR的原理 Polymerase Chain Reaction（PCR） ——聚合酶链式反应 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 实时定量PCR的原理 扩增与检测分开进行 使用荧光染料检测DNA 对PCR终点的DNA量进行定性或定量 使用凝胶区别不同片断大小的DNA DNA Engine 常规PCR的检测方法 实时定量PCR的原理 相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定 实时定量PCR的原理 实时荧光 PCR的检测方法 Chromo4 在扩增仪上整合荧光检测元件 使用荧光染料或荧光探针实时监测DNA产物的量 通过扩增曲线分析初始模板中特定基因的量 使用序列特异的探针区别不同的DNA 通过双链DNA的熔解曲线鉴定不同大小和序列的DNA分子 实时定量PCR的原理 初始模板的Log浓度与其Ct呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 确定初始模板的浓度 实时定量PCR的原理 106 105 104 103 102 10 106 105 104 103 102 10 unknown 104 103 Unknown contains 3108 copies 实时定量PCR的原理 荧光信号的获取 光源 光学元件 反应管 光学元件 热循环仪 检测 实时定量PCR的原理 实时定量PCR的原理 非特异性的荧光染料 SYBR Green I 特异性的荧光探针 TaqMan Molecular Beacon 等 DNA产物的荧光标记 实时定量PCR的原理 SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission 实时定量PCR的原理 SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 实时定量PCR的原理 R Q Taqman probes 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation 实时定量PCR的原理 Molecular Beacon R Q Excitation R Q Q R Excitation Emission 实时定量PCR在生物学研究中的应用 DNA定量 病原体检测 转基因动植物研究和转基因食品检验 基因整合拷贝数的研究 RNA定量 基因表达量研究，mRNA 基因型分析 SNP分析 法医学鉴定 应用举例一 乙肝病人血液中病毒量的绝对定