（精品课件）荧光定量PCR（Real Time PCR）实验原理，实验设计和结果分析介绍.ppt

（Real Time PCR） 主要内容 Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR 实验方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 应用实例 Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 ( C-代表Cycle，t-代表threshold） Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR检测方法 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 TaqMan探针为一寡核苷酸， 5’端标记一个报告荧光基团(Reporter)， 3’端标记一个淬灭荧光基团(Quencher)。 Cycling probe为一寡核苷酸，5’端标记一个荧光报告基团(Reporter)，3’端标记一个荧光淬灭基团(Quencher)，寡核苷酸为DNA/RNA杂合体。 SYBR Green I法vs Probe法 SYBR Green I 法 ◆优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针。 ◆缺点：引物要求高（要求特异性扩增）、不能进行多重PCR。 Probe法 ◆优点：特异性强，能进行多重PCR。 ◆缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。 使用SYBR Green I 进行检测的问题点 Real Time 进入 SYBR Green I 时代 Real Time PCR 基础知识 各公司Real Time PCR检测系统比较 主要内容 Real Time PCR 实验方法 Real Time RT-PCR反应 Real Time PCR 实验方法 反转录反应 主要内容 Real Time PCR 解析方法 标准曲线分析 融解曲线分析 绝对定量和相对定量解析方法 基线平整 Negative control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽 质粒标准品构建 质粒标准品构建流程 标准曲线制作 标准品梯度的选择：5～6个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10 理想的标准曲线 相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。 Real Time PCR 解析方法 标准曲线分析 融解曲线分析 绝对定量和相对定量解析方法 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。 标准曲线分析 融解曲线分析 绝对定量和相对定量解析方法 通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 主要内容 检测方法 Cycling Probe法 SNP位点 ALDH2 type1和ALDH2 type2 (G/A) 使用试剂 Cycleave PCR Core Kit TaKaRa Code.CY501 使用仪器 Smart Cycler Ⅱ 模板DNA 体外转录的Internal control RNA电泳照片 检测方法 SYBR Green I荧光嵌合法 管家基因 GAPDH基因 目的基因 X基因 标 准 品 体外转录RNA 试 剂 SYBR? ExScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time） TaKaRa Code No.DRR053 仪 器 Line-Gene33 主要内容 试剂选择的要素 TaKaRa Perfect Real Time相关试剂在各种仪器上的适用性 TaKaRa Perfect Real Time相关试剂与其它公司同类产品的比较 TaKaRa Perfect Real Time相关系列产品特点 TaKaRa Real Time相关试剂的选择 使用方便性 →2×Premix type，无需反应条件摸索。 高扩增效率→可以检测低拷贝DNA模板。 高反应特异性→可在宽广范围内进行准确定量。 与Real Time PCR检测系统的匹配性→选择适用于各种Real Time PCR检测系统的试剂。 价格因素→降低实验成本。 试剂名称 SYBR? Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time） Code No.：DRR041 实验结果 试剂名称 SYBR? Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time） TaKaRa CodeDRR041 以及A、B、C、D公司同类试剂 适合各种