real time PCR 操作手册.doc

Real-time PCR 检测 (protocol) 实验流程描述： 收集生长状态良好的目的细胞，提取RNA，并反转录成cDNA采用real time PCR 方法检测 目的基因的表达情况。 实验材料： 1．主要试剂 REAGENTS COMPANY Cat.No. Trizol Invitrogen 15596-026 M-MLV 逆转录酶 promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(RF) 上海吉凯 SYBR Master Mixture TAKARA DRR041B 2． 主要仪器 EQUIPMENTS COMPANY Cat.No Nanodrop 分光光度计 Thermo 2000/2000C 稳压电泳仪 上海天能 Real time PCR 仪器 TAKARA 公司 TP800 实验步骤： 1 总RNA 抽提（根据Invitrogen 公司的Trizol 操作说明书进行） 1) 收集细胞，2000rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1ml Trizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5 ml EP 管中； 2) 每管加入200 μl 氯仿，用手上下颠倒eppendorf 管15s，室温静置10min； 3) 4℃，12800 rpm，离心10min； 4) 吸取上层液体移至新的1.5 ml EP 管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10 min； 5) 4℃，12800 rpm 离心10 min 后，弃上清； 6) 加入1 ml 75%乙醇（用DEPC水新鲜配制），洗涤沉淀； 7) 4℃，11800 rpm 离心5 min，弃去大部分上清； 8) 4℃，11800 rpm 离心5 min，弃去上清；室温干燥； 9) 待RNA 沉淀基本透明时，加入RNase-free 水（加入体积视RNA沉淀量而定）至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C分光光度计分析测定所抽提RNA 的浓度及质量。 2 RNA 逆转录获得cDNA（根据Promega 公司M-MLV 操作说明书进行） 实验所需耗材均购自Axygen，具体步骤如下： 1) 将1 μl Oligo dT(0.5μg/μl) 和2.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，补充RNase-Free H2O至10ul；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT 和模板退火； 2) 按下表的比例配制反应体系（冰上进行），混匀，短暂离心； 试剂 每管加入量 5×RT buffer 4 μl 10mMdNTPs 2 μl Rnasin（40U/ul） 0.4 μl M-MLV-RTase（200U/ul） 1 μl RNase-Free H2O 2.6 μl 注：dNTPs 是dATP , dCTP, dGTP, dTTP 的混合，浓度为10mM 3) 上述体系在42℃水浴反应1h，然后在70℃水浴10min 使RT 酶失活； 4) 将得到的RT 产物--cDNA 置于-80℃保存备用。 3 Real-time PCR 检测 1) 按下列比例配置反应体系： 试剂 每管加入量 SYBR premix ex taq: 10.0 μl 上游引物（2.5μM） 0.5μl 下游引物（2.5μM） 0.5μl cDNA 1.0μl RNase-Free H2O 8.0 μl 2)两步法进行Real-Time PCR，并制作熔解曲线，程序如下： 4．数据分析 见实验报告 4/ 4