测序常见故障排除.pdf

基因分析平台的常见故障排除 1 开始故障排查前„ • 界定问题 • 进行对照实验 • 检查基本要素 • 利用可用的资源尝试解决问题 2 开始故障排查前：进行对照实验 pGEM Control Reaction BigDye® Terminator Ready Reaction Mix 8 µl M13 -21 Primer 4 µl pGEM Control DNA 1 –2 µl H O 6 –7 µl 2 用与处理样品同样的方法进行对照实验和纯化 3 开始故障排查前：进行对照实验 • 测序标准品：验证仪器性能。如果失败，通常表明毛细管、胶、缓冲液、 注射器、缓冲液托盘、septa 、塑料制品或者硬件可能出现问题。 • pGEM Control DNA: 验证仪器性能和测序过程。如果pGEM Control DNA 测序失败而标准品测序通过，可能测序试剂盒、PCR仪、纯化步骤、引物或 者DNA模板存在问题。 • 内对照：验证引物、PCR扩增以及模板。如果测序标准品和pGEM control 测 序成功，那么可能是模板DNA 、用于PCR扩增的引物或者是模板的纯化出现 问题。 4 DNA测序的常见问题 5 样品准备问题 • 没有进样/样品 • 进样过多 − 模板太多 − pull down峰 • 多种测序产物 • 测序引物质量差 6 没有进样/样品 查看原始数据 7 没有进样/样品 查看分析后的数据 8 进样过多 • 由于模板太多或者测序反应太强导致信号过强 • 在原始数据里，如果信号强度超过正常范围，软件将不能正确地分析数 据: − 片段分析和测序： 注意：进样太多时RFU值是以软件分析的值为基础的。进样太多会导致碱基误读和信 号突然降低的情况。测序信号过强或者进样太多将导致测序数据中PCR产物中的劈峰 (Split Peaks)和pull up峰(peaks under peaks) 出现。 9 进样过多 - 模板太多 如果样品中含有太多的DNA ，荧光标记的ddNTP就会很早结合上去，出现 “头重”的现象。数据前面信号很强，随着反应进行信号变弱导致测序读 长变短。调整DNA模板的量通常可以避免这种现象。 10 进样过多–pull down峰 上图为进样太多的原始数据，信号非常强的区域出现pull down峰(负峰) 11 进样过多–pull up峰 峰的底部出现可辨别的峰。如果采用错误的spectral/matrix 或者由于光路 改变需要重新做spectral校准时也会发生类似情况。 12 样品准备的问题：多种产物 13 样品准备的问题：多种产物 可能原因： • 非特异PCR产物或测序产物 • 多克隆 • 可能存在插入缺失突变 • 水/环境的污染 • Septa污染 14 测序引物质量差 引物合成时部分引物多一个碱基（N+1 ） 15 常见问题- 硬件 • 检测出渗漏的错误信息 • 数据中出现气泡 • 拖尾峰 • 放电现象 16 | Genetic Analysis System Training | Jan 2011 胶中的气泡引起钉子峰 原始数据图谱。左边的图是右边显示窗口中钉子峰图的放大图。注意所有四种颜色 都在一个很窄的钉子峰中出现，有别于胶和D