第二章 蛋白质定量分析教案.ppt

 蛋白质定量分析：BCA法 生物化学教研室（303室） E-mail:dajingjing0927@126.com 内容 BCA法测定蛋白质含量 蛋白质定量分析的方法 操作注意事项 思考讨论 BCA法测定蛋白质含量 2.掌握分光光度计的使用。 实验原理 BCA (bicinchoninic acid,二辛可酸） 实验步骤 （一）实验材料 1、器材 721型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管 2、试剂 （1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒 石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体 混合后调pH至11.25。 （2）试剂B：4%硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。 （4）蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于 100mL蒸馏水中，即为1.5mg/mL的蛋白质标准液。 （5）待测样品。 数据有改动 （二）实验操作 1、将上述各管混匀后于37°C保温30分钟， 用562nm波长比色测定吸光度值。 2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵 坐标绘制标准曲线。 3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相 应的蛋白质含量M，再计算出待测血清中 蛋白质浓度（g/L)。 蛋白质定量分析的方法 紫外线吸收法 改良微量凯式定氮法 双缩脲法 Folin-酚试剂法 考马斯亮蓝结合法 BCA法 BCA法的特点 注意事项 1、实验分组 2、准确量取试剂，吸管残余液体要吹出。 3、平行加样，物归原位。 4、正确使用分光光度计，比色杯不润洗。 5、正确绘制标准曲线，标注名称、姓名、 仪器型号、作图时间。 6、实验结果书写规范，三线表。 可见光分光光度计的操作步骤： 1）预热仪器。 2）选定波长。 3）固定灵敏度档。一般固定在“1”档。 4）调节“0”点。 5）调节T=100％。 6）测定。 7）关机。 表1 BCA法测定蛋白质含量 思考讨论 1、蛋白质定量分析的多种方法中，哪种方法更适合测定血清蛋白的浓度，说出你的理由？ 2、实验设计及实验操作过程中，有没有可改进的方法，如果有请说出你的想法？ 一、蛋白质的相关理论知识 2、蛋白质的紫外吸收 3、蛋白质的呈色反应 * * 讲解络合反应、螯合物以说明试剂的稳定性好 中心离子和多齿配体结合形成具有环状结构的配合物，具有更高的稳定性。 我们知道蛋白质浓度和吸光值成正比，那么根据L-B定律 A=KCL，一种方法是标准曲线法，另一种方法就是2颜色相近的标准计算求的。 提问：为什么要设置空白管，它的作用 实验设计的讲解 实验结果画三线图 这些方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定，有可能得出几种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。 强调标准曲线是通过原点的一条直线。偏差太大的点应该舍去 注意事项的强调 提问：蛋白质的元素组成有哪几个：C H O N S P 16%代表什么意思？ 简述凯氏定氮法的原理：将蛋白氮转化为氨，用酸吸收。通过测定氨的含量来计算蛋白质的含量。 提问：BCA法理论依据是什么？ 蛋白质分子中的肽键及氨基酸残基的各种特殊基团，在一定条件下可以和某些化学试剂呈现一定的颜色反应，颜色的深浅与其浓度成正比。 定性分析 定量分析 有没有 是不是 有多少 实验目的 1.掌握BCA法测定血清蛋白质 浓度的原理。 BCA分子式 BCA试剂盒 实验原理 紫蓝色 562nm 表 1 BCA 法测定蛋白质含量 管号 试剂（ mL ） 空白管 1 2 3 4 5 测定管 标准蛋白溶液 （ 0.3mg/ml ） — 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 — 蒸馏水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 — — 待测样品 — — — — — — 0.5 BCA 工作液 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0