第二章-蛋白质的定性定量分析课件.ppt

3. 注意事项 柱床表面不能干燥 凝胶的选择 Sephadex 溶胀 G值的意义 凝胶柱的再生与保存 第 三 节 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点 等电点 (isoelectric point, pI) 两性电解质性质 支持介质 (supporting media) Figure of IEF + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 Isoelectric Focusing ReadyStripTM IPG Strips 3–10 4–7 3–6 5–8 7–10 3–10NL 3.9–5.1 4.7–5.9 5.5-6.7 6.3-8.3 High-purity monomers Narrow ranges for resolution of low-abundance proteins Overlapping gradients for “cyber gels” Three lengths 7 cm, 11 cm and 17 cm 0.5 mm x 3.3 mm Broad Range pH 3-10 Narrow Range pH 4-7 Micro Range pH 4.7-5.9 3 10 4 4 7 7 4.7 5.9 4.7 5.9 注意事项 两性电解质的选择 电极缓冲液 对样品的要求 样品必须无盐 加样的量要适当 加样方法 加样位置 第四节 蛋白质的免疫印迹分析 印迹技术 (blotting)是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术 1975年，Edwen Southern提出了分子印迹(渍)的概念 目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测 印迹技术的类别及应用 DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析 RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析 蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究 由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为 免疫印迹技术 (immunoblotting) 一、免疫印迹分析的应用 对蛋白质进行定性分析 对蛋白质进行半定量分析 信号转导分析 生物大分子相互作用分析 将蛋白质固定在膜上的其他应用 结构域分析 斑点印迹 抗体纯化 为制备抗体时获得相应的蛋白质抗原 蛋白质鉴定：氨基酸组成分析和序列分析 * 第二章 蛋白质的定性定量分析 蛋白质定性分析 (qualitative analysis) 确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质 蛋白质定量分析 (quantitative analysis) 确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量 蛋白质含量的测定方法（重点掌握） 蛋白质相对分子量测定 (SDS) 等电聚焦电泳 (IEF)（一般了解） 蛋白质的免疫印迹分析 (western blot) 第一章 蛋白质的含量测定 蛋白质的含量测定 基于蛋白质的 元素组成特点 基于蛋白质的 化学显色反应 基于蛋白质的 光吸收特性 蛋白质元素组成的特点 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％ 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此 只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据 以下公式推算出蛋白质的大致含量： 100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100 1/16% 一、紫外光谱 (A280)吸收法 这一方法可用来快速检测溶液中是否含有 蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋 白质的洗脱峰 原 理 色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近 大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法 芳香族氨基酸的紫外吸收 优 点 快速 缺 点 核酸可引起强干扰作用 芳香族氨基酸含量差异可以起误差 对蛋白质无破坏性 不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液 计算方法 标准曲线法 蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45×A280-0.74×A260 注意事项 石英比色杯 调零所用溶液 配制标准蛋白所用溶液 光密度范围 二、考马斯亮蓝G-250检测法