黄粉虫酪氨酸羟化酶原核表达、活性测定及其在黑化过程中的作用的中期报告.docx

黄粉虫酪氨酸羟化酶原核表达、活性测定及其在黑化过程中的作用的中期报告 本研究选择了黄粉虫（Tenebrio molitor）中与色素合成相关的酪氨酸羟化酶基因（tyrosine hydroxylase, TH）作为研究对象，采用原核表达系统对其进行表达，进一步探究其在黑化过程中的作用。 1. 基因克隆 从黄粉虫幼虫体内提取总RNA，加入逆转录酶进行逆转录，得到cDNA。根据公开的Tenebrio molitor基因组序列，设计引物，扩增出TH基因的全长cDNA序列。将其插入到pET-28a(+)载体中，构建出THpET28a表达质粒。 2. 原核表达 将THpET28a质粒转化到BL21 (DE3) E. coli中，进行IPTG诱导表达。运用Western blot、SDS及staining技术对重组蛋白进行检测。结果表明，TH基因已成功在E. coli中得到表达，且具有较高的表达量和纯度。 3. 活性鉴定 运用HPLC-MS/MS方法检测TH基因表达后，在E. coli中获得的重组酪氨酸羟化酶蛋白的活性。结果表明，重组酪氨酸羟化酶能够将酪氨酸转化成3,4-二羟基苯丙氨酸，表明其具有活性。 4. 黑化过程中的作用 首先对黑化过程中黄粉虫中TH基因表达量的变化进行实时荧光定量PCR。结果表明，TH基因在黑化过程中呈现出逐渐上升的趋势。 进一步通过Western blot、SDS及staining技术对黑化过程中TH蛋白的表达和分布进行研究。结果表明，在黑化过程中，TH蛋白表达量增加，且呈现出明显的变化，表明TH基因在黄粉虫黑化过程中发挥了作用。 综上，本研究利用原核表达系统成功表达了黄粉虫中与色素合成相关的TH基因，并证明其具有较高的活性。通过研究黄粉虫的黑化过程，还发现TH基因在其中起到了重要作用。该研究为探究黄粉虫黑化机制提供了有力的支持和依据。