第三讲 吸光光度法.ppt

 第三章 吸光光度法 (Absorption photometry) 吸光光度法(Absorption photometry) —基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。包括比色法、紫外-可见吸光光度法、红外光谱法。本章讨论溶液的可见吸光光度法（分光光度法，简称光度法）。 吸光光度法 根据物质的吸收光谱（λυ）及光的 吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种方法。 第一节 物质的吸收光谱 一、物质对光的选择性吸收 二．物质的吸收光谱(A-λ图） 以波长?为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，可得一曲线，即为吸收光谱(absorption spectrum)或称吸收曲线(absorption curve),右图为不同浓度时三(邻二氮菲)合铁(II)配离子的吸收光谱。 二、物质的吸收光谱 将不同波长的单色光依次通过有色溶液，测量溶液的吸光度A(absorbance)。 以波长?为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得吸收曲线，或称吸收光谱。 吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用?max表示。 特点: ① 具有最大吸收波长。 ②不同物质, λmax不同，λmax 是定性分析的依据。 ③λmax几乎不随物质的浓度而变。 ④λmax附近，A最大，并与浓度c呈正比关系 ---- 定量分析依据。 ⑤远离λmax的光,物质几乎不吸收光（A→0）,这些光的A与物质的c无直接关系----不作定量分析依据。 注意：物质对光的吸收越多，呈颜色越深，溶液浓度越浓。 一、透光率和吸光度 入射光 I0 ? 吸收Ia ?透射It I0= Ia+ It 透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率(transmittance)，用T表示 透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。A愈大，溶液对光的吸收愈多。 二? Lambert―Beer 定律 当 I0 一定时，A只与液层厚度（b）和 溶液浓度C 有关： ① Io，c 一定, A∝b ② Io，b 一定, A∝c ∴ A = εbc or A = abr 注意： Beer定律仅适用于单色光。 单位： 　b ---- cm。 　a为吸光系数：L g-1 cm-1 , c单位:g/L。 ε为摩尔吸光系数：L·mol-1·cm-1，c单位：mol/L， a与ε的关系:ε= aM 　M表示被测物质的摩尔质量。 例13-1：已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇配成浓度为0.150 mmol?L-1的溶液，在480 nm波长处用2.00 cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数?及质量吸光系数a。 解： 例13-2：测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度如下 A(280nm) = 0.46， A(260nm) = 0.58， 试计算 每一组分的浓度。 已知：酶的?(280nm) = 2.96?104 L?mol-1?cm-1 　　　　　?(260nm) = 1.52?104 L?mol-1?cm-1 　　　AMP的?(280nm) = 2.4?103 L?mol-1?cm-1 　　　　　　?(260nm) = 1.5?104 L?mol-1?cm-1 　　　吸收池厚度为1.00cm。 第三节 可见分光光度法 一 分光光度计 　分光光度计仪器型号很多，但其基本原理相似，其主要部件用方框图示意如下　光源 →单色光器 →吸收池 →检测器 →讯号处理 及显示器 一、分光光度计 主要部件 光源 ? 单色光器? 吸收池 ? 检测器 ? 讯号处理及显示器 光源：钨灯，发出320~3200nm的连续光谱， 单色光器：以棱镜或光栅分光，提供单色光。 吸收池：分光光度计中用来盛放溶液的容器。 检测器：通过吸收池的光转换为光电流，再经放大输入指示器，然后显示。 二、测定方法 　　　可见分光光度法常用于定量测定，根据Lambert-Beer定律，在一定波长条件下，吸光度与浓度成正比，因此在分光光度计上测出吸光度，就可以通过下列方法即可求出被测物质含量: 二、测定方法 标准曲线法 取系列浓度标准溶液，测定吸光度A，作吸光度A对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线。 在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液浓度。 1.标准曲线法 在测定溶液吸光度时，为了消除溶剂或其它物质对入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界