生物大分子实验报告.doc

高级生物化学与分子生物学 综合实验报告 实验目的 以特定酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化为主线，进行基因操作、蛋白质表达、亲和层析纯化等的训练，通过集中训练熟练生物化学和分子生物学实验操作，为独立开展研究生课题研究奠定实验基础。 实验原理 利用基因重组技术，将目的基因与载体质粒DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA转化到感受态细胞，通过一定的诱导条件，使之在受体细胞内增值表达相应的目标蛋白。为了得到相应的目标蛋白，需要通过亲和层析等手段纯化目标蛋白。 三、 实验内容 一）内容一：重组质粒的分离、鉴定与转化 　　　　　　实验1. 重组质粒的分离、纯化及检测 　　　　　　实验2. 质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收 　　　　　　实验3. 感受态细胞的制备、连接与转化 二）内容二：重组蛋白在大肠杆菌中的表达 　　　　　　实验4. 细菌的大量培养及重组蛋白的诱导 　　　三）内容三：重组蛋白的提取、纯化与鉴定 　　　　　　实验5. 细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化 　　　　　　实验6.　目标蛋白的SDS鉴定 实验1 质粒DNA的分离、纯化及检测 材料、设备及试剂 一、材料 　　转化的细菌，1.5ml塑料离心管,离心管架。 　　二、设备 　　微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽灭菌锅，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。　　三、试剂 　1. LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)5 g，酵母提取物(Yeast extract) 2.5g，NaCl 5g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积500 mL，高压下蒸气灭菌20分钟。2. LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。 3. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存备。4. 质粒提取试剂盒。 操作步骤 1. 细菌的培养和收集 　将含有质粒的菌种用无菌牙签挑取平板上的单菌落接种到2-5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。 2. 取液体培养物1.2 mL于Eppendorf 管中，然后6000 g/min离心2 min，弃上清。 3. 质粒的提取，参照质粒提取试剂盒说明。 4． -20℃保存DNA以备电泳检测。 实验2 质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收 材料、设备及试剂 　　一、 材料 　　质粒； HindⅢ酶及其酶切缓冲液；琼脂糖(Agarose) 　　二、 设备 　　水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。 　　三、 试剂 　　 50×TAE电泳缓冲液； 6×电泳载样缓冲液。 操作步骤 　　一、 DNA酶切反应 　　1. 反应体系组成： 10X Buffer 5 μL HindIII 1 μL Plasmid 20 μL H2O 24 μL 　2. 混匀反应体系后，将eppendorf管置于泡沫板上，37℃水浴保温1小时，使酶切反应完全。 　3. 停止反应，置于冰箱中保存备用。 二、 琼脂糖凝胶电泳 　　1. 取50×TAE缓冲液4ml加水至200ml，配制成1×TAE稀释缓冲液，待用。 2. 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 1×TAE稀释缓冲液，轻轻摇匀，溶胀30min，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化。　　3. 胶板的制备：将有机玻璃胶槽放好，插上样品梳子。将冷却至50-60℃的琼脂糖胶液小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。 　　4. 加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。 5. 电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。 6. 染色观察和拍照。 7. 回收条带，用回收试剂盒。步骤参见试剂盒说明书。 实验3 感受态细胞的制备、连接与转化 材料、设备及试剂 　　 一、材料　　E. coli BL21/DE3菌株: Amp-；无菌eppendorf管。 试剂 LB液体培养基、T4