激光共聚焦扫描显微镜和其在生物学上的应用.pdf

激光共聚焦扫描显微镜及其在生物研究中 的应用 一. 激光共聚焦扫描显微镜（以下简称LSM）： 1. 利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并 利用计算机对所观察分析对象进行数字图象处理的一套观察和分析系统。 2. 主要系统组成：激光源、共聚焦显微镜（正置、倒置、透射、落射、荧光、 微分干涉）、探测器（光电倍增管）、计算机以及数字图象输出设备（显示器、 彩色打印机和照片幻灯片制作设备）。 二. LSM 技术、原理和特点： 对于一个在传统显微镜下观察的生物样品来说，其结构往往是非常复杂的， 而且又互相重叠，给观察带来很大困难。特别是在荧光显微镜观察中，由于荧光 标记物质和自发荧光结构重叠，紧密合在一起，而传统落射荧光显微镜物镜不但 收集来自焦平面的光线，而且还收集焦平面上下的散射光线，因此影响了光分辨 率。 共聚焦成像仅检测反射自焦平面的光线部分，从而解决上述问题。光源通 过一个针孔使在焦平面上形成一个小而精细的光点，从焦平面上发射出的光线通 过物镜收集，光束通过光束分离器，沿着光路返回，进入探测器，同样在进入探 测器前也要通过一个针孔。这种焦平面的几何共轭设计使来自焦平面的光点正好 进入针孔会聚，而焦平面外的光束会聚于针孔板前或后，被阻挡不能通过针孔进 入探测器。探测到的就是来自焦平面的。 共聚焦显微镜的光分辨率以及 Z 轴上的光切厚度不但取决于光的波长，而 且也决定于物镜的数值孔径和针孔的直径。其中针孔孔径的大小与分辨率成反 比。 通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，同时将一个连续 的光切图象Z 轴重叠就可形成一个三维图象。另外，在同一平面上随时间进行连 续扫描，就可分析细胞结构、内含、和标记等的动力学变化。 另外，为了适应目前生物医学研究技术的飞速发展，特别是各种荧光染料的 运用，以及各种荧光蛋白家属标记的运用，多重荧光标记的生物样品观察。现在 最先进的激光共聚焦显微镜已经能够同时扫描这些多重标记的荧光标记，并加以 精确的区分，同时也可以观察随时间变化，这些荧光标记由于各种生物学因素而 产生的波长改变（具体见下述META 技术简解），从而研究到组织和细胞内分子间 的相互作用关系。 三. LSM 在生物学上的应用： 激光共聚焦显微镜适用于细胞生物学、细胞生理学、神经生物学和神经生 理学等几乎所有涉及细胞研究的医学和生物研究领域。 在医学生物学上应用的最大特点是对活细胞进行无损伤性的实时观察分 析。能对活细胞，组织进行形态和功能相结合的研究，包括细胞、组织结构的精 确描绘、定位（二维和三维）和上述结构的动态变化，进行准确的定性、定量、 定时和定位分布观察，细胞生物物质、离子的准确定性、定量、定时和定位分布 1 检测，细胞离子通道的直观观察和变化的动态描绘，细胞在生理和病理及药理情 况下对外界因素（细胞处理和药物的作用等）产生快速反应的实时记录等。  用途： 1. 适用于细胞生物学、细胞生理学、神经生物学和神经生理学等几乎所有涉及 细胞研究领域。 2. 对活细胞进行无损伤性的实时观察分析，进行形态和功能相结合的研究。对 细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图象可及时输出或 长期储存。 3. 对活细胞和组织或细胞组织切片进行连续断层扫描，能获得精细的单个细胞 或一群细胞或所观察的局部组织的各个层面结构（二维和三维）（包括细胞 特异结构－如细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统，样品的深层结构） 和完整的三维图像（如分析随时间变化，即四维图象，也可进行随荧光波长 变化的图象，即可达到更多维的图象）。精确定位组织细胞及其他所需要观 察的对象结构的空间位置，进行实时动态的观察、分析和记录；精确分析的 定性、定量、定时和定位分布。 4. 荧光标记探针标记的活细胞或切片标本的细胞生物物质，膜标记、细胞示踪、 免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行 同时多重物质标记，同时观察。 5. 细胞内离子荧光标记，单标记或多重标记，检测细胞内如pH 和钠、钾、钙、 镁等离子浓度的比率测定及其动态变化； 6. 细胞膜电位测量，自由基的检测等； 7. 进行精确定位的荧光漂白恢复（FRAP）实验，结合荧光漂白中荧光丢失（