水溶性维生素的测定.doc

第三节水溶性维生素的测定 水溶性维生素B1、B2C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足，但由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化需求外，任何多余量都会从机体中排出。为避免缺乏，需要经常由饮食来提供。 水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部分或全部被破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。 由于水溶性维生素具有上述特性，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。维生素B1、B2一、维生素B1的测定(荧光法，GB/T5009.84—2003)B1又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。动物组织不如植物含量丰富。 维生素B1在水中溶解度较大，在酸性溶液中较稳定，在碱性溶液中加热极易分解。 近年来对利用带荧光检测器的高效液相色谱测定法进行了许多研究，并应用于实际试样测定。这里我们主要介绍荧光法（参考GB/T 5009.84-2003 食品中硫胺素(维生素B1)的测定） （一）荧光法 1．原理 试样在酸性溶液中加热，提取维生素B1，经蛋白分解酶处理，使维生素B1成为游离型。再经层析柱纯化，去除荧光淬灭物质，同时浓缩，用碱性铁氰化钾溶液将其氧化成硫色素，在紫外线下，硫色素发出荧光，再给定的条件下以及没有其他物质干扰时，此荧光之强度与硫色素量成正比即与溶液中维生素B1量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂志分离，然后以所得溶液做测定。 2．试剂 ⑴ 盐酸（0.1mol/L）：8.5mL浓盐酸（相对密度1.19或1.20）用水稀释至1000mL； 盐酸（0.3mol/L）：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL； 乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL； 氢氧化钠溶液（150g/L）：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL； 无水硫酸钠； 乙酸钠溶液（2mol/L）：164g无水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL； 氯化钾溶液（250g/L）：250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL； 酸性氯化钾溶液（250g/L）：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL； 1%铁氰化钾溶液（10g/L）：1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL。放于棕色瓶内保存； 碱性铁氰化钾溶液：取4mL 10g/L铁氰化钾溶液，用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用； 正丁醇：需经重蒸馏后使用； 淀粉酶和蛋白酶； 活性人造浮石：称取200g 40目～60目的人造浮石，以10倍于其容积的热乙酸溶液搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的250g/L热氯化钾溶液搅洗15min；然后再用稀乙酸溶液搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存； 硫胺素标准贮备液（0.1mg/mL）：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000mL。于冰箱中避光保存；　　 硫胺素标准中间液（10μg/mL）：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。此溶液每毫升相当10μg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月； 硫胺素标准使用液（0.1mg/mL）：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，用时现配； 溴甲酚绿溶液（0.4g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL0.1mol/L氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。 仪器 电热恒温培养箱； 荧光分光光度计； Maizel-Gerson反应瓶； 盐基交换管。步骤 试样制备 试样准备 　　样品采集后用匀浆机打成匀浆保存于低温冰箱中冷冻，用时将其解冻后使用。干燥试样要将其尽量粉碎后备用。 提取 准确称取适量试样（估计其硫胺素含量约为10μg～30μg,，一般称取2g～10g试样）置于100mL三角瓶中，加入50mL0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，放入高压锅中加热水解，12130min，凉后取出。 用2mol/L乙酸钠调pH值为4.5（以0.4g/L溴甲酚绿为外指示剂）。 按每克试样加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45～50温箱过夜保温（约16h）。 凉至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液。 净化 用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的1/3高度。保持盐基交换管中液面始终高于活