蛋白质体外磷酸化方法的建立.pdf

·112 · 生物化学与生物物理进展 　　Prog. Biochem. Biophys. 　　　　　2003 ; 30 ( 1) 蛋白质体外磷酸化方法的建立 刘 　斌 　宋 　宜 　董 　燕 　孙志贤 (军事医学科学院放射医学研究所 , 北京 100850) 摘要 　蛋白质的磷酸化与去磷酸化调节方式在细胞信号传递过程中占有极其重要的位置. 建立鉴定蛋白质磷酸化 ( ) 的可靠方法具有重要意义. 毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白 ataxiatelan giectasia mutated , A TM 是直接感 受 DNA 双链断裂损伤 , 并起始诸多 DNA 损伤信号反应通路的主开关分子. 电离辐射 ( IR) 细胞学反应 中 , A TM 激酶可通过磷酸化活化 p 53 蛋白, 原核表达 p 53 融合蛋白, 免疫沉淀 IR 活化的野生型 A TM 蛋白, 进行蛋 白质的体外磷酸化反应. 实验验证了A TM 对 p 53 蛋白的磷酸化作用. 这一方法的建立可为研究细胞信号转导途 径中蛋白激酶对底物的磷酸化作用及筛查激酶底物提供标准化的技术手段. ( ) 关键词 　毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白 A TM , p 53 , 蛋白质体外磷酸化 , 电离辐射 学科分类号 　Q55 　　蛋白质的磷酸化修饰与去磷酸化过程是生物体 验利用细胞免疫沉淀得到 A TM 蛋白, 原核表达得 内存在的一种普遍的调节方式 , 几乎涉及所有的生 到p 53 融合蛋白, 建立蛋白质体外磷酸化系统 , 实 理及病理过程 , 如糖代谢 、光合作用 、基因表达 验验证了A TM 免疫复合物对 p 53 融合蛋白的体外 等. 对这一过程的研究是 目前细胞信号转导研究领 磷酸化作用. 域中极为重要的课题之一. 因此 , 建立鉴定蛋白质 1 　材料与方法 磷酸化的可靠方法具有重要意义. 本实验以毛细血管扩张共济失调症突变蛋白激 11 　材料 ( ) 原核表达载体 p GEX6P1 , 菌株 BL 2 1 及蛋白 酶 at axiatelangiect asia mut ated , A TM 对 p 53 蛋 白的磷酸化反应为例. A TM 是人常染色体单基因 质亲和层析柱 ( GSTrap TM FF , Cat N O . 175 130 隐性遗传病 毛细血 管扩 张共 济 失调症 ( at axia 02 ) 购 自Amer sham Pharmacia 公司. Trizol 试剂 telangiect asia , A T) 的致病基因 , 其编码蛋白 C 端 ( Cat N O .) , 反 转 录 酶 ( MML V 含有磷脂酰肌醇3磷酸激酶 ( P I3 K) 结构域 , 其 Rever se Transcript ase , Cat N O . 280250 13 ) , 回收 活性可被 P I3 K 激酶家族抑制剂 Wort mannin 所抑 试剂盒 ( Concert TM Rapid Gel Ext raction System , 制 , 被认为是 P I3 K 激酶家族的重要成员. 在细胞 Cat N O . 114560 19 ) 均