混合菌代谢产物中有机酸的鉴测分析.ppt

混合菌代谢产物中有机酸的鉴测分析 研究意义 实验方法 实验过程概述 实验内容 实验结论 致谢 研究意义 微生物可以利用诸如高浓度有机废水、固体生物质等可再生资源来生产氢气，达到除掉垃圾和产能的双重目的， 具有广泛的应用前景。我国己在“国家十一五科技发展规划”和“863计划”中将“可再生能源制氢新技术”列入新能源等战略高技术领域中的前沿技术。 酸含量会影响产氢菌中产氢酶的活性，合适浓度的酸含量使产氢酶保持较高的活性。因此，混合菌代谢产物中有机酸的定性定量分析，对于确定最优产氢条件具有十分重要的意义。 实验方法 测定混合菌代谢物中有机酸的检测方法包括硅胶色谱法、有机酸自动分析法、纸色谱法、薄层层析法、毛细管电泳法、离子色谱法、气固或气液色谱法以及高效液相色谱法等。目前研究使用较多的是气相色谱法和高效液相色谱法。用高效液相色谱法测定时易受杂质的干扰，气相色谱法具有高效能，高选择性，高灵敏性且应用范围较广。本次试验对混合菌代谢物进行甲酯化后，用气相色谱法实现定性定量分析。 实验过程概述 混合菌代谢物的甲酯化 确定最优检测条件 绘制外标曲线 实现定量分析 混合菌代谢物离心后，定量上清液加入到一个洁净干燥的试管中，加入适量的甲醇和催化剂。用橡皮塞塞紧试管口。在适宜温度下反应一定时间，反应完成经正己烷萃取后进行气相色谱分析。 改变柱温，升温速率确定最优检测条件。 绘制外标曲线时以正己烷为溶剂，采用梯度稀释法配制出一系列不同浓度的标准液。 外标曲线方程给出了浓度与气相色谱峰面积之间的关系，已知峰面积后就可以计算出混合菌代谢物中有机酸的浓度。 混合菌代谢产物预处理后气相色谱图 实验内容 酯层提取方法的确定 混合菌代谢物预处理方法的选择 气相色谱检测条件的确定 标准溶液溶剂的选择 外标曲线的绘制 确定预处理过程的最优反应时间 确定甲酯化程度 确定有机酸的浓度 一、酯层提取方法的确定 饱和食盐水 甲酯化后，向溶液中加入饱和食盐水，增大无机相的浓度，可以实现有机相和无机相的分层 正己烷萃取 反应完成后，向混合液中加入适量的正己烷萃 取出酯层。 酯层提取方法为：正己烷萃取 二、混合菌代谢物预处理方法的选择 序号 甲酯化方法 色谱峰面积 1 BF3-CH3OH 29853.4 2 0.4mol/L氢氧化钾-甲醇 30548.6 3 10%硫酸-甲醇 29785.6 4 2.5mol/L硫酸-甲醇 34548.6 5 酸碱结合 32789.5 6 1%硫酸-甲醇 36120.9 最优甲酯化方法为 ：1%硫酸-甲醇 甲酯化法 三、气相色谱检测条件的确定 气相色谱分析时采用程序升温法，分别比较了以下检测条件下所得结果。 起始温度：70℃; 终止温度：180℃ 升温速率：20℃/min 起始温度：50℃; 终止温度：180℃ 升温速率：20℃/min 起始温度：50℃; 终止温度：180℃ 升温速率：10℃/min 最优检测条件为：起始温度：50 ℃; 终止温度：180 ℃ 升温速率：10℃/min 四、标准溶液溶剂的选择 序号 溶剂种类 停留时间/min 1 甲醇 0.76 2 正己烷 0.76 3 异辛烷 0.72 　　　　标准溶液溶剂为：正己烷 五、外标法确定有机酸甲酯的浓度 丙酸甲酯外标曲线 丁酸甲酯外标曲线 五、外标法确定有机酸甲酯的浓度 戊酸甲酯外标曲线 五、外标法确定有机酸甲酯的浓度 序号 物质 外标曲线方程 1 丙酸甲酯 Y=1491.2X+346.72 2 丁酸甲酯 Y=1119.9X+143.88 3 戊酸甲酯 Y=1841.6X+164.6 六、确定预处理过程的最优反应时间 序号 反应时间/h 丙酸浓度g/L 1 0.5 5.728 2 1 5.338 3 2 4.772 最优反应时间为：0.5 h 七、甲酯化程度的确定 准确量取一定量的丙酸，经甲酯化后，通过外标曲线确定所得丙酸甲酯的量，可以计算出甲酯化程度为86.94%。 八、确定有机酸的浓度 最终确定在最优甲酯化条件和最优检测条件下测得混合菌代谢物中丙酸的浓度为5.728g/L。 实验结论 在预处理阶段最优甲酯化方法为： 1%硫酸-甲醇 甲酯化法；最优反应时间为：0.5h。