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猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法

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猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法

摘要：猪流行性腹泻病毒（PEDV）是影响养猪业的重要病原体，其N基因作为病毒复制和致病的关键基因，对其检测具有重要的意义。本研究针对PEDVN基因设计了一套RT-RAA荧光定量检测引物对，并开发了一套试剂盒。通过优化反应条件，实现了对PEDVN基因的高灵敏度检测。本研究结果为PEDV的快速、准确检测提供了技术支持，对防控PEDV疫情具有重要意义。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是猪的一种高度传染性疾病，对养猪业造成巨大经济损失。PEDV感染后，病毒在猪体内大量复制，导致猪只出现腹泻、呕吐等症状，严重时甚至导致死亡。近年来，随着PEDV变异株的出现，给养猪业的防控带来了新的挑战。因此，对PEDV进行快速、准确的检测对于防控PEDV疫情具有重要意义。本研究旨在开发一种基于RT-RAA荧光定量技术的PEDVN基因检测方法，为PEDV的防控提供技术支持。

一、引言

1.猪流行性腹泻病毒的概述

(1)猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）是一种单链RNA病毒，属于冠状病毒科。该病毒主要感染猪，特别是幼猪，能够引起严重的腹泻和脱水症状，严重时可导致幼猪死亡。PEDV的首次发现可以追溯到1971年，最初在丹麦和德国的猪群中爆发。随后，该病毒在全球范围内广泛传播，给养猪业带来了巨大的经济损失。

(2)PEDV的病毒粒子呈球形，直径约为60-220纳米，具有一个螺旋状的单链RNA基因组。该病毒基因组编码多个蛋白质，包括核衣壳蛋白（N蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、spikes蛋白（S蛋白）等。其中，N蛋白在病毒复制和致病过程中发挥关键作用，是疫苗研发和诊断检测的重要靶点。PEDV的传播途径主要是通过粪-口途径，病毒可以在猪舍环境中存活较长时间，增加了防控的难度。

(3)PEDV感染后，猪只通常会出现急性腹泻、呕吐、食欲下降等症状，严重病例还会伴随脱水和酸中毒。由于PEDV具有高度传染性，一旦感染，病毒可以在短时间内迅速传播，导致猪群大量死亡。目前，针对PEDV的防控措施主要包括疫苗接种、生物安全措施和药物治疗。然而，由于PEDV变异较快，疫苗和药物治疗的效果有限，因此，研究新的检测方法和防控策略对于降低PEDV对养猪业的危害具有重要意义。

2.PEDVN基因的研究现状

(1)PEDVN基因作为病毒基因组的一部分，编码核衣壳蛋白，对于病毒颗粒的组装和稳定至关重要。近年来，随着分子生物学技术的进步，对PEDVN基因的研究取得了显著进展。研究者们已经成功克隆和测序了PEDVN基因，并对其结构、功能和变异特性进行了深入研究。这些研究为PEDV的分子诊断、疫苗设计和病毒防控提供了重要基础。

(2)在PEDVN基因的研究中，研究者们发现该基因存在多种变异类型，包括点突变、插入和缺失等。这些变异可能影响病毒株的致病性、免疫逃逸能力和传播能力。通过对不同变异株的N基因进行比较分析，研究者们揭示了PEDV的进化机制和流行趋势，为制定针对性的防控策略提供了重要信息。

(3)PEDVN基因的研究还包括了其与宿主免疫反应的关系。研究表明，N蛋白可以与宿主免疫系统中的抗体和细胞因子相互作用，影响病毒的感染过程和致病性。此外，N蛋白的变异可能影响其与宿主细胞受体的结合能力，从而影响病毒的感染效率。因此，深入理解PEDVN基因的功能和变异特性，对于开发新型疫苗和抗病毒药物具有重要意义。

3.RT-RAA荧光定量技术的原理与应用

(1)RT-RAA荧光定量技术（ReverseTranscription-AmplificationReal-TimeAssay）是一种基于实时荧光定量PCR的检测方法，用于检测和定量RNA病毒。该技术通过逆转录将RNA模板转化为cDNA，然后利用PCR技术进行扩增，并通过实时荧光信号的变化来监测扩增过程。据文献报道，RT-RAA技术的检测灵敏度可达到10^-5copies/μL，比传统的PCR方法提高了约100倍。

(2)在应用方面，RT-RAA荧光定量技术已成功应用于多种RNA病毒的检测，包括HIV、HCV、EBV等。例如，在一项针对HCV的检测研究中，RT-RAA技术检测的灵敏度达到了10^-6IU/mL，显著高于传统的ELISA检测方法的10^-3IU/mL。此外，RT-RAA技术在禽流感病毒H5N1的检测中也显示出了优越的性能