葡萄球菌的鉴定及测序 王琳.ppt

葡萄球菌的鉴定及测序 学生姓名：@@ 导师：### 汇报内容 一.背景 二.目的和意义 三.技术路线 四.实验结果 五.讨论 六.结论 一.背景 葡萄球菌属（Staphylococcus）是一群革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，故名。 葡萄球菌属是一种普遍存在于自然界中的人兽共患病菌。要防治葡萄球菌引起的疾病，诊断是一个关键。传统的分离鉴定、理化方法及体细胞测定，不仅费时费力，而且缺乏特异性 。 本研究从聚合酶链式反应PCR 扩增的角度，选择特异性引物扩增16S rRNA基因片段，以染色体为模板，进PCR扩增与测序分析，确定是否葡萄球菌。16S rRNA基因是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，基因高度保守，不同细菌都有不同程度的差异，可设计不同引物对特定细菌进行PCR检测。 二.目的和意义 本研究从聚合酶链式反应PCR 扩增的角度，选择特异性引物扩增16S rRNA基因片段，以特定DNA为模板，进行PCR扩增与测序分析，对葡萄球菌进行鉴定和测序，并将测序结果与GenBank标准序列进行Blast，得出葡萄球菌的16S rRNA的PCR产物序列与标准序列同源性差异。为菌种库补充数据资料，为检测葡萄球菌属菌株引发的疾病提供资料。 三.技术路线 引物设计 模板DNA制备 PCR扩增 PCR产物胶回收 测序 基因序列同源性比较 四.实验结果 1.模板DNA制备：装有葡萄球菌0785，金黄色葡萄球菌0046，葡萄球菌0517，葡萄球菌0084的试管中的菌液均混浊，细菌生长良好。但是装有葡萄球菌0399的试管的菌液未见混浊。 2.PCR产物电泳结果 250bp 3.测序结果 0785的16s rRNA碱基测序长度为177bp； 0046的16s rRNA碱基测序长度为 173bp； 0571的16s rRNA碱基测序长度为174bp； 0084的16s rRNA碱基测序长度为179bbp。 4.16S rRNA的序列同源性比较结果 菌株 Genbank相似序列菌株名称 登录号 同源性 葡萄球菌0785 Staphylococcus hominis partial 16S rRNA gene FN393804 98% 金黄色葡萄球菌0046 Uncultured bacterium clone RP_1aaa03d02 16S ribosomal RNA gene EU778371 99% 葡萄球菌0517 Uncultured bacterium clone RPSD_1aaa01a02 16S ribosomal RNA gene EU468114 97% 葡萄球菌0084 Staphylococcus vitulinus 16S rRNA gene AM062694 97% 菌株0785与葡萄球菌标准株的16s rRNA序列同源性为92.82% 菌株0046与葡萄球菌标准株的16s rRNA序列同源性为75.56% 菌株0517与葡萄球菌标准株的16s rRNA序列同源性为76.67%。 菌株0084与葡萄球菌标准株的16s rRNA序列同源性为91.71%. 五.讨论 技术路线：凝胶电泳纯化过程中PCR产物条带与引物二聚体分离不充分，胶回收有难度，切胶时为将两者充分分离开，需要损失部分PCR产物，以保证产物足够纯净。造成PCR产物条带与引物二聚体分离不充分的原因有二：一，实验中凝胶浓度为1%，而文献中建议电泳凝胶浓度1.5%。凝胶浓度低，阻力小，分子量大的产物没有足够阻力以区别与分子量小的产物。二，电泳时间过短，两种产物没有足够时间充分分离。 结果分析 模板DNA的制备：葡萄球菌0399的试管的菌液未见混浊，可能是菌液反复冻存 ，使细菌死亡，无法增殖出细菌。 将菌株0785，菌株0046，菌株0517 和葡萄球菌0084与GeneBank数据库中己知的葡萄球菌属（Staphylococcus carnosus subsp. utilis CIP105758）16S ribosomal RNA gene进行多序列比较后得到的同源性百分比均达到70%以上 ，验证了这四株菌株均为葡萄球菌属，并为菌种库补充有效的数据资料。 其中菌株0785和葡萄球菌0084与Genbank中标准序列进行比对后发现同源性高达90%以上，可以确定这两株为葡萄球菌。 其中两株菌株0046和菌株0517与Genbank中标准序列进行比对后发现同源性在70%-80%之间，分析原因可能由于是PCR产物直接测序，没有连接T载体，使测序结果产生偏差。 六.结论 菌株0785，菌