《动物生化实验》实验四、牛乳中蛋白质提取与鉴定.ppt

牛乳蛋白质的 提取与鉴定 一、实验目的： 了解蛋白质的化学性质； 掌握蛋白质的提取方法和鉴定理。　　 二、实验原理： 牛乳中含丰富的蛋白质（水分87.8%、脂肪3.5%、蛋白质3.1%、乳糖4.9%、灰分0.7%、能量29.kg/100kg），其中主要是酪蛋白。酪蛋白在牛乳中约占总蛋白量的5/6。 1、酪蛋白提取的原理 蛋白质是含羧基和氨基的两性电解质，在某一pH值溶液中，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，蛋白质以两性离子状态存在，这时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点（PI）。 在等电点时，蛋白质所带净电荷为零，溶解度最小，蛋白质沉淀析出，利用蛋白质的这个特点可将蛋白质提取出来。 由于粗提出的酪蛋白中还含有脂肪，可用乙醇和乙醚洗涤除去。 2、酪蛋白鉴定的原理 酪蛋白中含有酪氨酸残基，酪氨酸残基的R基团为： 含酚羟基，可与米伦试剂反应先生成白色絮状沉淀，继续反应生成红色沉淀。 酪蛋白中还含有含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸），在碱性溶液中水解后可与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅。 三、操作步骤 （一）酪蛋白的制备 新鲜牛奶、醋酸纳缓冲液各5ml 40℃ 分别加热至同样温度 上清液：保留做鉴定（烧杯）（三） 边加边摇混匀 5min 沉淀 加4ml95%的乙醇 离心5分钟 上清液：弃去 沉淀：做鉴定 （二）酪蛋白的性质鉴定 1、溶解度 取3支试管+ 0.1M NaOH、 0.2M HCl、 10%NaCl各2ml+少许酪蛋白→振荡→观察溶解快慢。 2、米伦反应 1ml H2O 少许酪蛋白 观察 10滴米伦试剂。加热 3、含硫氨基酸的（胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸）鉴定： 1ml 0.1M NaOH5 5 滴5%醋酸铅 少许酪蛋白 溶解 加热煮沸 观察 （三）乳清中可凝固性蛋白质鉴定： 将第一次离心所得的上清液徐徐加热，出现蛋白质沉淀（球蛋白、清蛋白）。 四、实验结果 五、讨论 二、常用生化仪器使用 离心机 离心技术（centrifugal technique）：根据颗粒作匀速圆周 运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来 的一种分离技术。 离心技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物，在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。 离心机种类 按用途： 有分析用、制备用及分析-制备分； 按结构特点： 有管式、吊蓝式、转鼓式和碟式等； 按转速： 有为常速（低速）、高速和超速三种。 实验室用普通低速离心机 实验室普通离心机使用方法 1.将离心机放在坚实而平整的工作台上； 2.在适用的离心管中加入样品，必须对称配重，否则会损坏离心机； 3.按离心机转头的离心管位置刻度所对应孔插入，放下离心机顶盖； 4.检查确认调速钮处于最低速位置； 5.打开电源开关，调速到需要的转速； 6.选择工作时间，调“选时”钮到需要的位置。 7.离心完成，离心机自然停止。 2、离心机使用注意事项 (1）严禁各种液体和杂物进入离心工作室，那样会损坏主机； （2）仪器电源线应有良好的接地，以免发生意外； （3）离心机工作时不要打开顶盖； （4）电压的高低以及不稳定现象直接影响本机的转速（但不会损坏电机）。对转速要求较高的使用场合，请使用稳压装置，使运转速度稳定。 * * 2000r/min离心 *