实验三琼脂糖凝胶电泳案例.pptx

实验二、琼脂糖凝胶电泳;1、学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 2、检测质粒DNA的纯度、浓度和分子量 ;琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。（GoldviewI的原理可能类似） 质粒DNA有环状超螺旋、开环、和线性三种构型，电泳时其迁移率各不同(超螺旋 线性 开环)。;不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围;上次实验提取的质粒 pSK（3 kb） 和MP3 （6 kb） ;该质粒载体用的是pUC的复制子，拷贝数能达到500-700个。;四、仪器设备;六、试剂;七、实验步骤;1、称取1 g琼脂糖加入盛有100 ml 0.5?TBE电泳缓冲液的250 ml三角瓶中，摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解，放在天平上加蒸馏水至原重量。冷却到约60℃后，加入10 ?l的Goldview I，并摇匀。 2、将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入制胶模具中，直至厚度为4-6 mm，插入适当的梳子，在室温下冷却凝固。 3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电泳槽中，加0.5?TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。 ;打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约一小时后即可观察。;1、用微波炉煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。 2、煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。 3、倒胶注意厚度(4-6 mm)，充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10分钟，以加速胶的凝固。 4、??样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。 5、一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液（正极）洗几次即可再点下一个样品。 6、 凝胶中含有GoldViewI，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。;常用电泳缓冲液配方;TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存； TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀； 分离大片段最好用TAE，小片段用TBE； TBE存在硼离子，会对一些酶的活性稍有影响。 ;有的10 × loading buffer中多了一样SDS（1%），它会使酶类（如Taq酶和限制性内切酶）变性，有终止酶促反应的作用。但在电泳时（以PCR产物为例），在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一条带没有什么区别（大概1000 bp左右）。不加SDS的凝胶加样缓冲液只有电泳指示剂和沉淀样品的作用。;Loading buffer的功能： 第一、指示剂溴酚蓝和二甲苯青起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳； 第二、甘油或者蔗糖可以加大样品密度，使样品密度大于TAE或TBE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。 另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。 前沿指示剂溴酚蓝溶液在酸性条件下为黄色，碱性条件下为蓝色。因为提取的核酸一般都是溶解在碱性的TE缓冲液里，所以与loading buffer混合后变为蓝色。 Marker跟DNA用一样的上样缓冲液，跑出来的结果才好，如果marker预先混合了上样缓冲液，DNA样品的上样缓冲液还是尽可能找跟marker预混的上样缓冲液一致。;EDTA 是螯合剂，可以螯合钙和镁等金属离子，能够使金属依赖型核酸酶失活，从而防止DNA和RNA降解。;在紫外照射透视下，与双链DNA 结合的 吖啶橙呈现绿色荧光，而结合RNA或单链DNA 的吖啶橙则呈现红色荧光。;不同波长的紫外光;1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？;Plasmid DNA Line 1, λ-DNA EcoR I/Hind Ⅲ Marker; Line 2, PUC18 (2686bp); Line 3, EcoR I digestion of PUC18; Line 4, Ca