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耐热优化纤维素酶在大肠杆菌中的高效表达 　　纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生 物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系总称，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖，有效地减少了污染。随着纤维素酶在工业上的广泛应用，特别是在纺织工业和能源工业上的应用，它已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。大肠杆菌(Escherichia coli)具有繁殖迅速、培养简单、遗传背景清楚、基因克隆表达系统成熟完善等优点，是人们表达重组酶的第一选择。在大肠杆菌中表达外源基因受到的影响很多，比如表达载体的拷贝数和稳定性，翻译起始效率以及重组蛋白的稳定性。而翻译起始效率跟 mRNA5’起始端二级结构的稳定性以及稀有密码子的使用频率有着很大的关系。据报道，mRNA 翻译起始区域中的 SD 序列与翻译起始位点 ATG 之间的空间构象和翻译效率有很大关系。通过对大肠杆菌的各种编码基因分析，发现同义密码子的相对使用频率，即 RSCU(Relative synonymous codon usage) 的值不同。 　　热 纤 梭 菌 ( Clostridium thermocellum ATCC27405)是一种高温厌氧细菌，它的纤维素酶和半纤维素酶构成多酶复合体，纤维素酶主要是由内切β-1，4-葡聚糖酶 ( C1 酶)、外切 β-l，4-葡聚糖酶 ( Cx酶)和葡萄糖苷酶 3 种酶组成的。其中，内切 β-l，4-葡聚糖酶是分解纤维素最主要的酶。嗜热梭菌产生的纤维素酶耐热性好，但由于热纤梭菌是一种严格的厌氧菌，该菌的培养条件极其苛刻，其纤维素酶的分泌必须在高度厌氧的条件下进行，且菌株产酶量相对较低，不适合在工业中大规模发酵生产。而采用分子生物学手段，将嗜热酶基因导入大肠杆菌中高效表达，是一种非常有效的方法。 　　本研究将重组质粒 pHsh-celD 经过两步优化实现此纤维素酶在大肠杆菌 E． coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 中高效表达，构建高酶活、耐热和产酶条件要求低的纤维素酶基因工程菌，为该酶在工业上的开发及利用提供基础资料。 　　1 材料与方法 　　1． 1 材料 　　大肠杆菌 E． coli DH10B，E． coli BL21-Codon-Plus(DE3)-RIL(购自 Promega 公司) 采用 Luria-Bertani(LB) 培养基:胰蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5g / L，NaCl 10 g / L。固体培养基添加终浓度为 2%的琼脂粉。 　　质粒 pHsh-celD 由本实验室构建并保存。该表达载体 pHsh 是由大肠杆菌 σ32因子调控，包括一个热激启动子和终止子，通过热激诱导外源基因表达。 　　1． 2 方法 　　1． 2． 1 基因操作 热纤梭菌基因组提取与 DNA 操作采用分子克隆技术标准方法进行。质粒转化采用电转化方法进行，质粒和 PCR 产物采用 Qiagen plas-mid kit 和 PCR purification kit(Qiagen USA)纯化。 　　1． 2． 2 重组表达质粒 pHsh-celD mRNA 二级结构的优化 对重组表达质粒 pHsh-celD 的翻译起始位点AUG 附近的 mRNA 二级结构的空间构象和 mRNA二级结构的自由能进行在线分析(form1-2． 3． cgi)，在不改变目的基因编码区氨基酸以及启动子序列的前提下，利用同义突变的方法，达到破坏 mRNA 的核糖体结合位点及翻译起始位点的茎环结构，提高mRNA 自由能的目的，得到具有最佳 mRNA 二级结构及自由能的质粒 pHsh-celD I。所分析的序列选择为从转录起始位点 ACC 开始至下游 70 个碱基，由于所使用的载体是温控型载体，外源基因表达的温度是 42 ，因此在软件设置中将 mRNA 形成的温度由默认的 37 改成 42 ，其他设置为默认。 　　pHsh-celD 分析序列: 5’-ACCTGTTAACCGTCGA-CAAGAAGGAGATATACCCATGGAGGAGACCAAAGTGTCAGCTGCAAAAATAACG-3’;pHsh-celD I 分析序列:5’-ACTTATTAATATTAGAAAAGAAGGAGATATACAAATG-GAGGAGACCAAAGTGTCAGCTGCAAAAATAACG-3’。以重组质粒 pHsh-celD 为模板，设计引物 P1 和 P2 进行定点突变，引物序列如下(加粗部分为突变位点)。P1:5’-AAGAAGGAGATATACAAATGGAGGAGACCAAAGTGT-C-3’; P2: 5’-TTCTAATATTAATAAGTCATTGGATCAT-GGGGATGTTTC -3