5.第五章-原核生物的基因工程.ppt

3.包涵体的分离检测 菌体破碎 离心收集 清洗 高速研磨 高压匀浆 差速离心 去污剂处理。如TritonX-100,SDS,脱氧胆盐 4.包涵体表达系统的构建 将启动子和SD 序列安装在外源基因的5‘端即可。一般现在都有商业的表达载体卖，只要获得相应的载体，将外源基因正确的连接上去即可。 （二）分泌性表达 大肠杆菌中的表达蛋白或是留在细胞质中，或是分泌在细胞周质（细胞质与外膜之间）中，或是细胞外膜进入培养基中。作为基因工程产物，要使之分泌到培养基中，需要通过特殊的技术处理。 1.分泌型蛋白表达方式有以下优点： （1）.蛋白分泌到细胞外，使之稳定性提高，主要是避免了蛋白酶的降解作用； （2）.简化了后续的纯化过程，因为培养基中的成分都是蛋白分解物，在培养基中基本只有表达产物，其他成分是小分子，通过简单的分离纯化即可； （3）.分泌蛋白的信号肽将被切除，外源蛋白与信号肽相连，在信号肽被切除时，N-端甲硫氨酸残疾可以被切除。 2.蛋白质分泌的机制 表达蛋白的分泌分2类： （1）共翻译传递：原核细菌的分泌型蛋白的N-端有15—30个氨基酸残疾组成的信号肽（signal peptide),N-端前面几个残基为极性氨基酸，中部及后部为连续排列的疏水残基，它对蛋白质穿过疏水性的细胞膜是极为重要的。 （2）翻译后运输：分子伴娘(chaperone)SecB与新合成的蛋白结合,并控制其构想折叠；SecB与固定在内膜上的SecA结合；SecA与SecE和SecY复合体相连，在ATP的作用下，SecA将蛋白前体推入内膜，同时释放SecB因子；最后内膜分泌系统的信号肽酶切除信号肽序列，蛋白质被分泌到细胞周质中。 3.分泌型蛋白表达系统的构建 将分泌型蛋白的信号肽，如细菌的抗抗菌素的酶类蛋白的信号肽，连接到外源基因的上游即可构建成分泌型表达系统。 （三）融合型异源蛋白表达 将外援基因与载体上的蛋白基因（来自与受体细胞）连接在一起，形成一个编码框，一起表达。在内源蛋白和外源蛋白之间设计一个蛋白酶切位点，表达产物用蛋白酶切断，获得独立的外源蛋白。 1.融合蛋白表达的特性 ： （1）融合蛋白由于内源蛋白部分能正确折叠，减少被蛋白酶降解的可能性； （2）利用内源性蛋白部分的抗体、配体和底物特性进行分离纯化； （3）表达效率较高，通常选择的受体菌基因都是高表达基因，包括所有的与表达效率有关的因素都是相对较优的，所以表达效率很高，外源基因与内源基因一起高效表达，可提高表达效率。 2.融合表达体系的构建 构建融合表达体系需要考虑以下因素： （1）内源基因必须是高效表达的，并且配套以纯化方案； （2）外源基因位于内源基因的下游，并有相应的终止密码； （3）并非用完整的内源基因，以避免内源蛋白和外源蛋白的大小基本相同，使之在电泳分离是困难； （4）内源和外源蛋白之间设计有裂解位点； （5）外源基因与内源基因连接时阅读框要正确。 pMAL? 蛋白融合表达及纯化系统(Protein Fusion Purification (pMAL?) System) pMAL?系统是一种高效的蛋白融合表达及纯化系统。pMAL载体含有编码麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）的大肠杆菌malE基因，其下游的多克隆位点便于目的基因插入，表达N端带有MBP的融合蛋白。通过tac强启动子和malE翻译起始信号使克隆基因获得高效表达（1，2，3），并进一步利用MBP对麦芽糖的亲和性达到用Amylose柱对融合蛋白的一步亲和纯化（4） MBP-paramyosin-△Sal 融合蛋白表达及纯化的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果A: Lane 1:未诱导菌 Lane 2:诱导表达菌B: Lane 1:过amylose柱，麦芽糖洗脱后的纯化蛋白, Lane 2:经Factor Xa切割后的纯化蛋白, Lane 3:经amylose柱二次洗脱后的paramyosin片段 （四）寡聚型异源蛋白的表达 提高重组质粒的拷贝数可以提高表达水平，但提高拷贝数后，由于重组质粒上其它基因的表达，消耗宿主细胞的能量，导致宿主细胞的生长受到影响，以致表达水平反而下降。 另一种策略是将多个外源基因拷贝串联克隆在低拷贝的质粒上，形成寡聚型外源蛋白表达系统 寡聚型异源蛋白的表达系统的构建策略： 1.多表达单元型重组：每个独立的表达单元包括启动子、终止子、SD序列、起始和终止密码子。多个这样的独立表达单元串联起来。每个单元可以是同向也可以是反向。每个单元表达的蛋白分子也是独立的。表达产物不需断裂处理，其中的N-端甲硫氨酸没有除去。适合表达较大的蛋白质。 寡聚型异源