基因工程课件-第五章 大肠杆菌基因工程.pptx

大肠杆菌基因工程;D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策;A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征;大肠杆菌表达外源基因的劣势;识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。;β 和 β′亚基以NTP为原料在模板上合成RNA。 δ70亚基识别启动子-35与-10之间的特异序列。转录开始后就脱离全酶。 α亚基与调节蛋白结合，决定RNA多聚酶转录的频率。;;反意义链;; 含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno(S-D)序列。;二、原核表达系统的注意事项;启动子;DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 没有启动子，基因就不能转录。;启动子;启动子;consensus sequences;5’-TTGACA-3’;启动子;启动子;启动子;启动子;启动子;转录终止子; 由于茎环3‘段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录而不利于转录延续。 ;;（2）Rho依赖型终止策略;Rho依赖型终止策略;终止子;终止子;核糖体结合位点;核糖体结合位点;核糖体结合位点;核糖体结合位点;核糖体结合位点;核糖体结合位点;密码子;密码子;/dnaworks/;密码子;;密码子;/RACC/;http://www.kazusa.or.jp/codon/;;http://www.jcat.de/ 密码子优化;质粒拷贝数;质粒拷贝数;质粒拷贝数;C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略;包涵体型异源蛋白的表达;包涵体型异源蛋白的表达;包涵体型异源蛋白的表达;包涵体型异源蛋白的表达;提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略;分泌型异源蛋白的表达;分泌型异源蛋白的表达;分泌型异源蛋白的表达;分泌型异源蛋白的表达;分泌型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;寡聚型异源蛋白的表达;寡聚型异源蛋白的表达;寡聚型异源蛋白的表达;整合型异源蛋白的表达;整合型异源蛋白的表达;整合型异源蛋白的表达;整合型异源蛋白的表达;整合型异源蛋白的表达;整合型异源蛋白的表达;整合型异源蛋白的表达;蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建;蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的??建;蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建;蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建;蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建;D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策;基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制;基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制;基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制;改善基因工程菌不稳定性的策略;改善基因工程菌不稳定性的策略;改善基因工程菌不稳定性的策略;E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素;胰岛素的结构及其生物合成;人胰岛素的生产方法;人胰岛素的生产方法;人胰岛素的生产方法;人胰岛素的生产方法;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。;pKK223-3;表达诱导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）;载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞间质中。;pIN III-comA1;表达出的外源基因产物蛋白是与质粒上的菌体蛋白连接在一起的。 特点：便于融合蛋白的分离和纯化。;pGEX;大肠杆菌的所有启动子都有两段一致顺序。;5’-TTGACA;AUG左侧的三个碱基也有影响。?-半乳糖苷酶的mRNA中，AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；UUC、UCA或AGG时下降20倍。;翻译的起始位点与S-D序列必须接近到一定的程度。;转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费能量、不会干扰正常的表达。;选择强启动子序列，如tac、T7 等。 调整S-D序列与AUG碱基的距离 距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离，一般为5-9bp。 3. 改变起始密码下面的几组密码子，提高翻译的起始效率。 4. 减轻宿主细胞的代谢负荷，合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。;5. 提高表达产物的稳定性，防止被宿主的酶降解。;使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。;“外排”：蛋白质从细胞质跨内外膜到培养液中。 “分泌”：蛋白