瑞替普酶大肠杆菌表达载体的构建及功能鉴定.docx

瑞替普酶大肠杆菌表达载体的构建及功能鉴定 血管紧张引起的各种心血管疾病严重威胁着人类的生命，是死亡和疾病的主要原因之一。全世界每年心血管病患者多达1 300万, 其中急性心肌梗死 (AMI) 死亡率高达30%。据统计, 在美国每年大约有90万人患有急性心肌梗死, 死亡人数达到22.5万, 其中有一半左右未得到治疗就已死亡 组织型纤溶酶原激活剂 (tPA) 是人体内正常存在的特异性纤维蛋白溶解物, 被用于临床血液栓塞病的治疗。然而, 由于tPA的体内半衰期极短, 只有3～5 min, 治疗时所需剂量高达50～100 mg, 因而在使用时不仅费用昂贵, 而且增加了周身纤溶性出血的危险性 rPA含有9对二硫键, 因此如何在大肠杆菌表达体系中形成正确的空间构象, 避免包涵体的形成使其可溶性表达, 便成了利用大肠杆菌系统开发生产rPA的瓶颈 1 各类限制内切酶及dna连接酶 . pfu DNA聚合酶、dNTPs、DNA快速纯化回收试剂盒为上海生工生物工程公司产品;各种限制性内切酶均为MBI公司产品;DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司;T4 DNA连接酶为Promega公司产品;琼脂糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 、5-溴-4-氯-3-吲哚-β- 2 2.1 40b-epa的质量粮食重建 根据tPA基因序列, 设计扩增rPA编码序列的特异性引物。上游引物:5′-CGGGGATCCG 2.2 葡萄糖浓度、诱导时间和温度的优化 当菌液 2.3 mes-mes法 超声波破碎菌体后离心, 将上清蛋白样品加到装有预先用2-吗啉乙磺酸 (MES) (50 mmoL/L, pH 6.1) 溶液50 mL平衡过的10 mL强阴离子交换树脂UNOsphereQ的色谱柱中, 用含有0.1 mol/L LiCl的MES (25 mmoL/L, pH 6.1) 溶液150 mL梯度洗脱rPA蛋白, 用部分收集器收集蛋白样品 (1.5 mL/管) 。纯化获得的融合蛋白利用Ⅹa因子切割去除DsbC标签后再次利用柱色谱进行分离纯化, 从而获得rPA目的蛋白。 2.4 凝血酶的制备 用FAPA测定重组目的蛋白的体外溶栓活性。所有溶液均用磷酸盐缓冲液 (PBS) 配制。先称量纤维蛋白0.02 g后迅速加到装有PBS 5 mL的锥形瓶中, 用枪轻轻吹吸, 摇匀, 放37 ℃培养箱预热, 10 min左右即可溶解。接着取少量凝血酶放入装有PBS 1 mL的EP管, 轻吹一下, 放入37 ℃培养箱预热。最后用PBS 7 mL溶解琼脂糖0.07 g, 加热至沸腾, 冷却至适合温度, 加入纤维蛋白和凝血酶摇匀后倒入平板中。凝固后打孔, 紫外灯下灭菌30 min。将样品加入孔中, 37 ℃下培养12 h, 观察溶栓圈产生情况 3 3.1 片段大小与预期的一致 如图1所示, PCR反应后在1.1 kb处可见明显的特异性条带, 片段大小与预期的一致。将此PCR扩增产物克隆到表达载体pET40b质粒DsbC下游, 获得rPA重组质粒。重组质粒经 3.2 最佳葡萄糖浓度的确定 诱导温度为30 ℃和诱导时间为5 h时, 在重组菌生长至 3.3 sds-东南角电泳 以已经确定的乳糖浓度 (终浓度为30 mmol/L) , 分别于25, 30, 37 ℃条件下诱导蛋白表达5 h时取样进行SDS电泳, 并与以前优化确定出的IPTG诱导条件 (终浓度0.6 mmol/L) 相比较, 结果如图3所示。诱导温度为30 ℃时, 利用乳糖诱导所获得的目的蛋白量与IPTG诱导表达量相当, 表达情况优于另外两个温度, 因此确定乳糖诱导最佳温度为30 ℃。 3.4 sds-东南角分析 以已经确定的乳糖浓度 (终浓度为30 mmol/L) 于30 ℃下诱导表达, 分别于诱导后1～6 h取样进行SDS分析, 并同时与IPTG的诱导条件 (持续时间3 h) 进行比较, 以确定乳糖诱导的最佳时间, 结果如图4所示。同一温度和乳糖浓度下, 在1～5 h内, 目的蛋白的表达量随时间延长逐渐最佳, 但至6 h后增加量较少, 即诱导表达5 h可在最少的时间内得到最大的诱导量, 因此选定诱导时间为5 h。 3.5 最佳诱导条件的确定 为了比较乳糖与IPTG诱导的结果, 选择乳糖诱导的最佳条件 (诱导终浓度为30 mmol/L, 诱导温度为30 ℃, 诱导时间为5 h) 与本研究前期优化确定的IPTG最佳诱导条件 (浓度0.6 mmol/L, 温度25 ℃, 时间3 h) 对收获的生物量和目的蛋白表达量进行比较, 结果如图5。以乳糖为诱导剂菌株生长略优于以IPTG为诱导剂;诱导剂和温度对菌株生长均有极显著影响, 以乳糖为诱导剂菌株的生长优于以IPTG为诱导剂。 3.6 重组蛋白的制备 DsbC