实验十一聚丙烯酰胺凝胶电泳.doc

PAGE  PAGE - 24 - 实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳 一：目的 1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术； 2、掌握同工酶遗传标记的分析方法； 二：原理 电泳(Electrophoresis)是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象称为电泳。大分子的蛋白质，多肽，病毒粒子，甚至细胞或小分子的 HYPERLINK /view/15155.htm 氨基酸,核苷等在电场中都可作定向泳动.1937年Tiselius HYPERLINK /view/2892372.htm 电泳仪进行血清蛋白电泳，它是在一U型管的自由溶液中进行的，电泳后用 HYPERLINK /view/3842435.htm 光学系统使各种蛋白所形成折光率差别成为 HYPERLINK /view/400.htm 曲线图象，将血清蛋白分为白蛋白,α1-球蛋白，α2-球蛋白，β-球蛋白和γ-球蛋白五种，随后，Wielamd 和Kanig 等于1948年采用滤纸条做载体，成功地进行了纸上电泳。从那时起，电泳技术逐渐被人们所接受并予以重视，继而发展以滤纸，各种纤维素粉， HYPERLINK /view/42594.htm 淀粉凝胶，琼脂和琼脂糖凝胶，醋酸纤维素 HYPERLINK /view/757628.htm 薄膜,聚丙烯酰胺凝胶等为载体，结合增染试剂如银氨染色， HYPERLINK /view/1362725.htm 考马斯亮蓝等大大提高和促进生物样品着色与分辨能力，此外电泳分离和免疫反应相结合，使分辨率不断朝着微量和超微量(1ng～0.001ng)水平发展，从而使电泳技术获得迅速推广和应用。 电泳的基本原理 生物大分子如蛋白质，核酸， HYPERLINK /view/84137.htm 多糖等大多都有阳离子和阴 HYPERLINK /view/149326.htm 离子基团，称为两性离子。常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。 如果把生物大分子的 HYPERLINK /view/443249.htm 胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和 HYPERLINK /view/268349.htm 电位梯度E.它们与介质的摩擦阻力f抗衡。在自由溶液中这种抗衡服从Stokes定律. F=6πrvη 这里v是在介质粘度为η中半径为r的颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种抗衡并不完全符合Stokes定律.F取决于介质中的其他因子，如凝胶厚度,颗粒大小，甚至介质的内渗等。  HYPERLINK /view/2911682.htm 电泳迁移率(mbility)m规定为在电位梯度E的影响下，颗粒在时间t中的迁移距离d. m=V / E t·E 迁移率的不同提供了从混合物中分离物质的基础，迁移距离正比于迁移率。 电泳是 HYPERLINK /view/1466754.htm 电泳涂料在阴阳两极，施加于电压作用下，带电荷的涂料离子移动到阴极，并与阴极 HYPERLINK /view/627227.htm 表面所产生的 HYPERLINK /view/1337053.htm 碱性物质作用形成不溶解物，沉积于 HYPERLINK /view/3841685.htm 工件表面。阳极电泳用水溶性树脂是一种高酸值的羧酸盐，在水中溶解后以分子和离子平衡状态存在于直流电场中，通电后，由于两极的电位差，离子定向移动，阴离子沉积在阳极表面，而阳离子在阴极表面获得电子还原成胺，它是一个电化学反应，包括电泳、电解、电沉积和电渗四个同时进行的过程。 1.电泳：在直流电压作用下，分散在介质中的带电胶体粒子在电场作用下向与其所带电荷相反的电极方面移动，叫电泳。 2.电沉积：阴离子树脂放出电子沉积在阳极表面，形成不溶水的漆膜，此过程叫电沉积。 3.电渗：电泳逆过程，当阴离子树脂在阳极上，吸附在阳极上的介质在内渗力的作用下，从阳极穿过沉积的漆膜进入漆液，称电渗。 4.电解：电流通过漆液时水便发生电解阴极放出氢气，阳极放出氧气，此过程即为电解。 电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην 可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径