海藻糖对酵母菌转型效率的影响.pdf

海藻糖對酵母菌轉型效率的影響 研究者 ：劉芸均 黃俐臻 指導者 ：李冠群教授 李宏孝老師 壹、介紹 一、海藻糖(Trehalose) 海藻糖(Trehalose)是自然界中常見的雙醣，由兩個 α 葡萄糖以 1-1 醣苷鍵 結合成，它是非還原性雙醣，在生物體內具有穩定性。海藻糖廣泛存在許多 生物體中，細菌、真菌、昆蟲，無脊椎動物及植物中皆有海藻糖的存在。海 藻糖能保護及並穩定許多生化分子，幫助生物在不利生存的環境存活。例如 線蟲在脫水時，會提高體內海藻糖含量並進入休眠狀態。也會幫助古生細菌 度過極熱、極冷、極酸及極鹼等逆境。在一些酵母菌的耐受性研究中，也從 滲透壓逆境，熱與脫水逆境的方面印證了海藻醣的重要性。對於海藻糖在生 物體內的保護機制有兩種假說，第一種是水的置換假說，由於海藻糖有許多 具極性的氫氧基，可以透過這些官能基靠近生化分子，在細胞脫水而取代水 的作用，穩定蛋白質與 DNA 等分子的結構。另一個假說則是海藻糖能形成有 保水作用的膜狀構造，藉此保護細胞。 二、酵母菌 Pichia pastoris 酵母菌是單細胞真菌，它結合了原核生物易操作，生長迅速的特性與真 核生物有蛋白質轉譯後修飾機制的優點，是轉型實驗中優良的蛋白質表現系 統。Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 是種已被深入了解並被廣泛使用的 菌種，但和另一種酵母菌 Pichia pastoris (P. pastoris)比起來，以 P.pastoris 作為蛋 白質表達系統有許多優點。P. pastoris 有可操作的強啟動子，且細胞本身只分 泌少量自身蛋白，透過它能得到大量且易於純化的目標蛋白。P. pastoris 對蛋 白質的轉譯後修飾和人類更為接近，它生產的蛋白質對哺乳類而言不如 S. cerevisiae 的俱抗原性。另外，外源基因在 P.pastoris 體內具有穩定性，在轉型 後能形成分泌特定蛋白穩定的細胞株。故基於以上理由，我們選擇 P.pastoris 為實驗的材料與目標。 貳、研究動機 現行的酵母菌轉型方法是電穿孔轉型。在將酵母菌製備成勝任細胞，增加細 胞膜的通透性後，把勝任細胞與 DNA 混合並施加電場，電流會在酵母菌細胞膜上 造成孔洞，讓 DNA 進入細胞。然而，電穿孔轉型的過程會對細胞造成傷害，降低 細胞存活率，進而降低轉型效率。轉型效率是單位重量的 DNA 能得到的轉型菌落 9 3 4 數，相較於大腸桿菌熱休克轉型 10 cfu/ g 的轉型效率，酵母菌 10 -10 cfu/ g 的轉 392 型效率相對是低的，且酵母菌電穿孔轉型需加入 5-10 g 的大量 DNA ，與大腸桿菌 的 50ngDAN 相比，實驗上需要更多成本。 海藻糖擁有保護生化分子的特性，且已被證實能應用在原核生物的轉型過程 中，提升桿菌(Bacillus subtilis, Escherichia coli )的轉型效率。若能將海藻醣幫助生物 抵抗逆境的特性運用到酵母菌的轉型，提升酵母菌的轉型效率與穩定度，將有利 於突變實驗後的菌株篩選，有更大的機會選到具高表現量的菌株，也能透過減少 DNA 添加量節省實驗流程與成本。 參、研究目的 以增添海藻糖的方式改良 Pichia pastoris 勝任細胞的製備程序，以提升轉型效率。 肆、研究設備及器材 一、 藥品與材料