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基因工程最基本的课件 工具酶DNA重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多都用作工具。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）在重组DNA技术中有重要地位，在此较详细介绍。DNA重组技术中最常用的工具酶限制性核酸内切酶?识别DNA特定序列，切断DNA链?DNA聚合酶 或其大片段（Klenow）缺口平移制作标记DNA探针 合成cDNA的第二链填补双链DNA3’凹端DNA序列分析 ?耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等）?聚合酶链反应（PCR）?DNA连接酶?连接两个DNA分子或片段?多核苷酸激酶?催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针?末端转移酶?在3’末端加入同质多聚物尾?SI核酸酶，绿豆核酸酶? 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端?DNA端酶?降解DNA，在双链DNA上产生随机切口?RNA酶A?降解除RNA?磷酸酶?切除核酸末端磷酸基?核酸酶核酸外切酶（exonuclease）：是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)：是从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。限制性核酸内切酶的命名用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称，如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示;如有株名，再加上一个字母，一种特殊的菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为Hind、Hind和Hind。限制性核酸内切酶的分类类限制性核酸内切酶? 由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。型限制性核酸内切酶与型限制性核酸内切酶相比， 型限制性核酸内切酶的特点是其切割位点在识别序列上与之靠近，并产生具有粘性末端或其它末端的一定长度的DNA片段。其三个基本特性如下：在DNA分子双链的特异性识别部位，切割DNA分子产生链的断裂；2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此相对的；断裂形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。限制性核酸内切酶的作用限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同。识别序列（切割位点、靶子序列）绝大多数的型限制性核酸内切酶，都能识别4-8个核苷酸组成的特定核苷酸序列，我们称这样的序列为核酸内切酶的识别位点，限制酶就是从识别序列内切割DNA分子的。有些识别序列是连续的，（如GATC），有些识别序列是断裂的（如GANTC），共同的特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，即回文结构。型限制性核酸内切酶的靶子位点是多样的，靶子序列长度不一样的限制酶，对DNA分子的随机切割频率不同。由限制酶的作用造成的DNA分子的断裂类型通常有两种：两条链上的断裂位置是交错的、但是对称地围绕一个对称轴排列，这种断裂的结果是形成具有粘性末端的DNA片段；两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形成的是平末端DNA片段。粘性末端，是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对重新环化，具平末端的DNA片段不易环化。有两种类型的限制酶都可以产生粘性末端:一种是形成具有3’-OH单链延伸的粘性末端；另一种是形成具有5’-P单链延伸的粘性末端.DNA限制性内切酶粘性末端配对重组同裂酶有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶这一类的限制酶来源各异，识别的靶字序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。影响限制性内切酶活性的因素1???? DNA纯度在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。2 核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)