基因工程(1)课件.ppt

2、噬菌粒載體：噬菌粒（phagemidorphasmid）是由單鏈噬菌體M13或f1與質粒載體重組而成的新型載體。它具有質粒的複製起點、選擇性標記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細胞內穩定存在；又具有單鏈噬菌體的複製起點，在輔助噬菌體的存在下，可進行噬菌體的繁殖，產生單鏈的子代噬菌體。四、YAC載體與YAC文庫：YAC（yeastartificialchromosome，酵母人工染色體）質粒載體是在人類基因組計畫（HGP）實施的背景下發展起來的一類克隆特大片段的載體。這類載體含有酵母菌的複製起點ARS（automaticreplicationsequence,ARS），著絲粒CEN（centromere），端粒TEL（telomere），以及選擇性標記和克隆位點；同時還含有大腸桿菌的複製起始點，可以在大腸桿菌中以環狀質粒的形式存在。DNA體外重組後以原生質體轉化的方式導入酵母細胞。這類載體克隆能力可達1~2Mb。主要用於基因組文庫的構建。原核生物主要載體用途小結：載體用途質粒λcosmidM13YAC大片段DNA克隆—++—+基因文庫構建—++—+cDNA文庫構建++———序列分析+——+—單鏈探針———+—工程菌+————五、真核生物載體：由於真核生物與原核生物在ＤＮＡ複製和轉錄系統上存在著差異，所以要求用不同的基因載體。真核生物基因工程載體的要求與原核生物基因工程載體大體相似，所不同的是：它除了含有真核基因的轉錄和複製的必要結構外，還必須含有細菌的轉錄和複製的必要結構，以便能在細菌中大量繁殖。含有細菌及哺乳動物細胞中的雙重選擇性標記，這就是所謂的穿梭質粒，可在哺乳動物和原核生物之間穿梭。植物基因工程載體：用於植物基因工程的載體有Ti質粒載體及病毒載體兩類。Ti質粒是存在於根癌農桿菌的一種質粒。根癌農桿菌感染植物時，會在植株的根——莖結合部產生未分化的細胞團，即冠癭瘤。有意思的是在形成冠癭瘤的同時，一部分Ti質粒（TDNA）可以重組到植物染色體中去，這一特性使Ti質粒有希望成為有效的植物基因工程載體，事實上，Ti質粒是迄今研究得最多的植物基因工程載體。由於Ti質粒的宿主範圍較窄，僅感染某些雙子葉植物，因此人們又發展了另一類植物基因工程載體——病毒載體。常用的植物病毒載體有以下幾類：ssRNA病毒：例如煙草脆裂病毒（TRV），必須先將單鏈RNA反轉錄成雙鏈的cDNA，才可作為載體。ssDNA病毒：例如雙子痤病毒，這類病毒可感染單子葉植物，所以是很有前途的一類載體。dsDNA病毒：這是研究得最多的植物病毒載體，例如花椰菜花葉病毒。哺乳動物基因工程載體：目前使用的哺乳動物基因載體大多由哺乳動物病毒經改造而成。用得比較多的病毒有猴空泡病毒（SV40）、單純皰疹病毒（HSV）、Rous肉瘤病毒、EB病毒等。在哺乳動物細胞內表達的載體必須考慮以下幾個表達元件：啟動子與增強子終止信號與加尾信號剪接識別信號複製與選擇元件選擇系統：HAT選擇系統——胸苷激酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（XGPRT）、二氫葉酸還原酶（DHFR）系統：嘌呤合成：穀氨醯胺+PRPPIMPAMPGMPFH4FH2HXGPRT天冬氨酸UMPCMPTMPFH4FH2TTK7,8二氫葉酸+NADPH+H+5,6,7,8四氫葉酸+NADP+DHFR氨甲喋呤抑制選擇原理：tk基因及xgprt基因的篩選：受體細胞必須是相應的tk-或xgprt-dhfr-，將細胞培養在含HAT（H：黃嘌呤，A：氨甲喋呤，T：胸苷）的培養基中。在A存在下，核苷酸的從頭合成途徑被阻斷，不能合成AMP、TMP及GMP。這三中核苷酸的合成只能有補償途徑合成，必須具有tk或xgprt基因的存在細胞才可生長。dhfr基因的篩選：受體細胞必須是dhfr-，將細胞培養在含HT的培養基中。新黴素抗性選擇系統：新黴素是原核生物的抗生素，對真核生物沒有抑制作用，但新黴素的類似物G418對真核細胞及原核細胞均具有抑制作用。新黴素抗性基因（neo）能在真核細胞中表達並能使G418失活（neo基因編碼一個磷酸轉移酶