DNA测序概述--非常全.ppt

DNA测序技术概述 2014年4月2日 DNA测序技术简介 DNA测序技术的发展 DNA测序技术的小结与展望 DNA测序简介 DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸。这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。对于每个生物体来说，基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。 测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报道，直至1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。此后三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，这些技术都采用了合成测序法，只是在DNA阵列的排布、DNA簇扩增，以及基于酶的测序生化反应方面存在差异。 第一代DNA测序技术 成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。 1977年Sanger发明了双脱氧链终止法。 同一时期, Maxam 和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。 这些技术统称为第一代DNA测序技术。 1.链终止法 双脱氧链终止法 原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种dNTP 存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸( ddNTP) ，因为双脱氧核苷没有3 ′ -OH，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3 ′ 端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3′端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 技术路线与要求 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 Sanger法DNA测序的试剂 1、模板 有两类DNA可以用做Sanger法测序的模板：纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA。采用从重组M13噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板效果最佳 。 ? 2.引物 酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。 M13噬菌体重组克隆的通用测序引物一般长15个~29个核苷酸，并可与紧靠M13mpl8噬菌体多克隆位点区的Hind Ⅲ位点或M13mpl9噬菌体多克隆位点区的EcoRⅠ位点的序列互补。这些引物同样也可用于对克隆于pUC质粒的DNA进行‘双链’测序。此外，还有若干家公司出售一些引物，这些引物是为了对通过多种限制酶切位点克隆于不同质粒的靶DNA进行测序而设计的。 ? 3、DNA聚合酶 通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的K1enow片段、反转录酶、经过修饰消除了3‘一5’外切酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶[测序酶(5equenase)]和测序酶序酶2.0版，以及耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)。 （1）大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow 这种酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然广泛用于DNA序列测定的酶，通常碰到的两个问题是：1)Klenow片段的持续合成能力低； 2)这种酶对模板中的同聚核苷酸或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低； 将聚合反应的温度提高到55℃，可以缓解但并不能彻底解决这一问题。 （2）反转录酶 尽管日常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个酶来解决一些由于模板DNA中存在A／T或G／C同聚核苷酸区而引起的问题。? （3）测序酶(SequenaseTM) 是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。该酶原来具有很强的3＇一5＇外切核酸酶活性，经过修饰后，这一活性大部分均被消除。测序酶2.0版完全缺失了3＇一5外切酶活性，极其稳定而且活性要比经化学修饰的测序酶高2倍。测序酶持续合成能力很强，聚合速