神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因bcl-2表达的影响.docx

神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因bcl-2表达的影响 脊柱损伤（rc）是一种严重的损伤，包括核电站损伤和后续损伤。原发损伤为不可逆性改变,而继发性损伤具有可逆性,且在原发性损伤后较长一段时间内显现。近年研究证实,神经细胞凋亡导致的神经元大量丢失是脊髓继发性损伤的重要病理机制,有效抑制这部分神经细胞的凋亡成为SCI治疗的一个重要途径。B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)能有效地抑制细胞凋亡,是迄今研究最深入、最广泛的凋亡调控基因之一。目前,神经干细胞(NSCs)移植成为治疗脊髓损伤的新的研究热点,但对移植后脊髓神经细胞的凋亡研究报道较少,本研究旨在动态观察胎鼠NSCs移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响,从而为NSCs移植治疗SCI提供理论和物质基础。 1 材料和方法 1.1 试剂和试剂 成年健康雄性清洁级SD大鼠,体质量250±20g(徐州医学院实验动物中心);5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)抗体(均Sigma公司),DMEM/F12(1:1)培养基(Hyclone),B27复合物(Gibco),bFGF(Invitrogen),EGF(Invitrogen),胎牛血清(杭州四季青),多聚赖氨酸(Sigma),巢蛋白(nestin)抗体(Sigma),NSE抗体(Sigma),DAB液体(Boster),Bcl-2单克隆抗体(Santa Cruz公司),SABC免疫组化试剂盒(Zymed),TUNEL试剂盒(Roche Diagnostics GmbH Mannheim),其他试剂均为国产分析纯或化学纯。自行研制的电控脊髓损伤自动打击装置。 1.2 胚胎神经干的分离、培养和鉴定 参见作者以往研究进行。 1.3 brdu对brvi的调整 移植前2d取处于对数生长期的NSCs离心后加入无血清培养液,轻柔吹打混匀成单细胞悬液,计数后调整种植密度为1106/ml,按20μmol/L的终浓度加入BrdU,放入培养箱中孵育48h,离心弃上清,用少量无血清培养液重悬成单细胞,计数后调整细胞浓度为2×105/μl。将移植后剩余细胞悬液进行台盼蓝(typan blue)染色,NSCs活性仍在90%～95%。 1.4 腰椎椎形骨折图5 SD大鼠40只按随机数字表法分为BrdU +NSCs组、NSC组、SCI组和假手术组(Normal组),每组10只。Normal组仅做椎板切开术。2%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(30mg/kg),以T10棘突为中心作背部正中切口,长约2cm,依次切开皮肤、皮下组织,剥离椎旁肌肉,轻轻咬除T10棘突和椎板,打开椎管至椎弓根部,暴露待损伤脊髓约5mm,注意保护硬脊膜完整。脊髓损伤(SCI)模型制备:用两把文氏钳分别钳住T9和T11棘突并向两侧牵拉以固定脊髓。以T10相对区域为损伤区,脊髓后正中血管为中心,用电磁程控铁棒下落打击装置(10g质量以5cm高度自由落下)致伤脊髓,打击强度为50(5.0cm×10g)势能克厘米(gram-cm force,gcf)。撞击成功标准为:撞击的脊髓组织水肿、出血,大鼠尾巴出现痉挛性摆动,双后肢躯体回缩样扑动,双后肢呈现弛缓性瘫痪。然后逐层关闭手术切口,记录手术时间,大鼠死亡及时复制模型补充。 1.5 小鼠硬脊膜无定形性nscs的开皮尔克氏体5.2.4 造模成功后即刻参考Miura等的方法行NSCs移植:麻醉后固定于立体定位仪上,原切口进入,在平T13棘突处硬脊膜背侧正中血管旁1mm处轻轻挑开硬脊膜成一纵行小口,用汉密尔顿微量注射器,向头侧呈45°角进针,深度1.5mm,将细胞浓度为2×105/μl的NSCs悬液5μl、生理盐水5μl分别注入NSC组、SCI组,10min内推入,保留5min后退出。 1.6 切片和细胞培养 NSCs移植后1、3、7、14、28d取材,大鼠在深麻醉下,以0.4%多聚甲醛行心脏灌流固定,取损伤段脊髓,在30%蔗糖磷酸盐缓冲液中沉底后,石蜡包埋固定,连续切片,片厚5μm,切片收集于装有0.01mol/L PBS的细胞培养板的两孔中,依次留片,每孔中留片15张。用SABC法行Bcl-2免疫组织化学染色,主要步骤简述如下:(1)60℃恒温烤箱中烤片1h。(2)二甲苯试剂依次脱蜡,梯度洒精依次浸泡,灭活内源性过氧化物酶,抗原修复。(3)滴加适当稀释的一抗Bcl-2后加入生物素化山羊抗小鼠IgG。(4)DAB显色,梯度酒精浸泡,中性树脂封片,晾干。阴性对照用PBS代替一抗。细胞胞浆中含有棕黄色颗粒者为阳性细胞。 1.7 tunel反应液制备 主要步骤简述如下:(1)切片脱蜡至水,3% H2O2室温10min。(2)0.01mol/L CB缓冲液(pH6.0)200ml中,750W微波修复1min,取出后迅速加入