骨髓基质细胞移植对大鼠脑缺血神经功能及bcl-2bax蛋白表达的影响.doc

骨髓基质细胞移植对大鼠脑缺血神经功能及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 王海英 刘静华 曹亦宾 马建国 吕宪民 李健 （唐山工人医院神经内科，河北 唐山 063000） 〔摘要〕 目的：研究骨髓基质细胞（BMSCs）静脉移植对脑缺血梗死大鼠的神经功能评分及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，进一步探讨骨髓基质细胞对脑缺血治疗作用和机制。方法： ⑴ MSCs悬液制备：贴壁+胰酶消化法分离培养大鼠骨髓基质细胞，取第4代细胞进行Brdu标记，收集、调整浓度后备用。⑵动物分组、造模、移植：SD大鼠54只，随机分为模型组( n = 18) 、磷酸盐缓冲液( PBS)组( n = 18)和MSCs组( n =18) 。模型组、PBS组和MSCs组采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血模型。PBS组和MSCs组于建模成功后24 h分别经尾静脉注入等体积的PBS液和已制备好的同种异体MSCs悬液。(3)神经功能评分：每组于脑缺血1d及7d、14d时行神经功能缺损评分及脑灌注固定取材,（4）HE染色，Bcl-2、Bax蛋白检测：采用免疫组化染色检测脑组织Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果 BMSCs移植组，与模型组和PBS组进行结果分析。 ⑴BMSCs治疗组大鼠的神经功能缺损评分（mNSS）在移植后7d、14d两个时间点都明显低于模型组和PBS组(P0.05) ，差异有统计学意义。⑵MSCs组7d、14d两个时间点Bax蛋白表达明显低于模型组和PBS组(P0.05)，MSCs组7d、14d两个时间点Bcl-2蛋白表达明显高于模型组和PBS组(P0.05)，差异有统计学意义。结论 经静脉途径移植骨髓基质细胞可显著促进脑缺血梗死大鼠的神经功能恢复，上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,减少神经细胞凋亡,可能是其主要机制之一。 关键词 骨髓基质细胞； 脑梗死；移植；凋亡；Bcl-2；Bax；大鼠 骨髓基质细胞（Bone Marrow Stromal Cell,BMSCs），也被称为骨髓间充质干细胞，因其可自我更新、多向分化的特性，以及可取自自体，具有临床应用的可行性，而成为干细胞疗法最具潜力的种子细胞[1]。本实验观察并分析了BMSCs移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的作用,及对大鼠脑组织神经细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达的影响,，以探索BMSCS的治疗作用和机制。 材料与方法 1．材料 健康雄性60只270-300g 及1只80-120gSD大鼠，购自北京维通利华实验动物中心（动物合格证号SCXK 京 2008-0001号）Gibco 公司）；FBS（Hyclone公司 ）；Percoll (北京鼎国生物Brdu单抗（Invitrogen公司）；bax、bcl-2免疫组化试剂盒（福州迈新公司）；其余试剂为国产分析纯。 2.MSCs悬液制备：颈椎脱臼法处死SD大鼠，无菌条件下取出双侧股骨、胫骨，暴露骨髓腔。用含10％FBS的LG-DMEM反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液于离心管中。离心后，弃上清，LG-DMEM 10ml重悬细胞，缓慢注入10ml Percoll（密度1.073g/ml）于液面上。再次离心分层后吸取单个核细胞层，洗涤两次后以10%FBS的LG-DMEM重悬细胞，反复吹打成单细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中。于5% CO2，37℃，饱和湿度温箱中培养。2～3d换液一次。贴壁细胞铺满瓶底80%以上时胰酶进行传代。分装接种到培养瓶内，培养。80%以上时SD大鼠54只，随机分为模型组( n = 18) 、磷酸盐缓冲液( PBS)组( n = 18)和MSCs组( n = 18) 。模型组、PBS组和MSCs组的大鼠均采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血模型。方法为参照Zea Longa〔[1]〕等方法稍作改良制作大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，即不分离翼腭动脉，从颈总动脉插入线栓，降低了手术的难度，避免了复杂的肌肉神经分离造成的损伤，提高存活率，术后不进行再灌注，造成永久性梗死模型。移植过程为严格无菌操作，大鼠MCAO后24h进行移植。10%水合氯醛( 3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，碘伏消毒鼠尾，应用微量注射器将总体积1 ml的单细胞悬液(内含3X 106个BMSCs)经大鼠尾静脉注入BMSC移植组大鼠体内；将lmlPBS经尾静脉注入对照组大鼠体内。动物清醒后送回笼内常规饲养。 4．大鼠神经功能评估：各组大鼠移植前及移植后1、7、14d时，由双盲于实验组的研究人员采用改良的神经严重程度记分（The modified neurological severity score，mNSS）评分法进行神经功能评分，每次评分随机抽取6只大鼠。最高分为18分，特异性反常行为或正常反射的缺乏得1分。分值越高，神经功能缺损越严重。 5．HE染色:各组大鼠于移