脐血干细胞移植联合电针治疗对损伤脊髓脑源性神经营养因子表达的影响.doc

脐血干细胞移植联合电针治疗对损伤脊髓脑源性神经营养因子表达的影响 　　摘要：目的 观察脐血干细胞（umbilical cord blood stem cells）移植联合督脉电针治疗对脊髓全横断损伤（spinal cord injury，SCI）大鼠的脑源性神经营养因子表达的影响。方法 建立SD大鼠T10脊髓节段完全横断模型，随机分为正常组、损伤模型组、督脉电针治疗组、脐血干细胞移植组、督脉电针治疗联合脐血干细胞移植组（分别简称正常组、模型组、电针组、脐血组、联合组），每组再分为3个时间段7 d、14 d、28 d，每组共大鼠18只。分别于7 d、14 d、28 d分离各组大鼠的脊髓组织，应用免疫荧光、RT-PCR和Western Blot技术定位、定量检测各组组织中脑源性神经营养因子BDNF的表达变化。结果 电针治疗组、脐血移植组和联合组脑源性神经营养因子的表达都高于损伤模型组，脐血干细胞移植联合电针治疗组表达量最高。结论 结果显示脐血干细胞移植和电针治疗具有协同作用，能显著提高脑源性神经营养因子的表达，对脊髓损伤的功能恢复有促进作用。 　　关键词：脊髓损伤；脐血干细胞；电针；脑源性神经营养因子 　　脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种严重的神经系统创伤性疾病，临床康复治疗效果仍不理想。中枢神经系统损伤后，神经营养素家族的表达发生改变，这些改变与神经系统的可塑性有重要关系[1]。成年哺乳动物脊髓具有可塑性，且针刺可促进脊髓可塑性[2-6]。研究证实，督脉电针可以改善损伤局部组织的血液微循环，促进脑脊液流动，减轻SCI部位的水肿、血肿的压迫及粘连，抑制脊髓继发性损伤，同时督脉电针治疗可以促进SCI脊髓神经轴突的再生[6]。在过去的几年中，干细胞成为再生医学的研究焦点。胚胎干细胞，尽管能够分化成所有三个胚细胞谱系层，但是它的使用受到伦理问题的限制[7]。自从1974年Kandtzon等发现人脐血中存在造血干细胞后，国内外学者对脐血干细胞的生物学、免疫学特性及临床应用进行了广泛的研究[8]，证实脐血可以作为一种新的干细胞来源治疗恶性血液病、退行性疾病及修复神经损伤等。目前，人脐血干细胞（human umbilical cord blood stem cell，hUCBSC）移植治疗脊髓损伤是脊髓修复领域的研究热点，在动物实验中已取得满意效果，并有初步的临床研究。本研究?⑷似暄?干细胞移植和督脉电针治疗联合应用，观察对脊髓损伤后BDNF表达的影响，以期为电针治疗联合脐血干细胞移植临床应用治疗脊髓损伤提供理论和实验依据。 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 实验动物选择与分组：90只成年雌性SD大鼠（SPF级），体重220～260 g，购自烟台绿叶制药有限公司。随机分为5组，正常组、损伤对照（CT）组、督脉电针治疗（EA）组、脐血干细胞移植（UCS）组、督脉电针治疗联合脐血干细胞移植（UCS+EA）组，每组18只。 　　1.2方法 　　1.2.1样本获取 ①造模后7，14，28 d各时间点每组随机取3只大鼠，40 g/L多聚甲醛心脏灌注固定，取损伤处头端长约1 cm脊髓组织，中性甲醛溶液后固定，石蜡包埋，切片。②造模后7，14，28 d各时间点每组随机取3只大鼠，脊髓新鲜取材，置-80℃冰箱冷存，以备提取蛋白及mRNA。 　　1.2.2免疫荧光组织化学观察 取各组标本石蜡切片，厚4 μm，常规脱腊至水；抗原修复；山羊血清封闭；滴加兔抗大鼠BDNF单克隆抗体（1∶200，abcam公司），4℃过夜；Cy3标记山羊抗兔IgG（1∶100，北京中杉金桥技术有限公司），37℃、30 min；DAPI复染；封片。在激光共聚焦显微镜下观察、照相。图像经LEICA QWin图像处理与分析系统处理，统计阳性表达面积（m2）、平均灰度值，分析BDNF的阳性表达变化。 　　1.2.3 RT-PCR检测 采用Trizol试剂盒（Invitrogen公司），根据说明书操作，提取各组脊髓织中的总RNA，溶于20 μL DEPC-H2O，-80℃冰箱冷存。 　　BDNF引物序列：上游：5-ATAGCAGGGCAGTTGGACA-3；下游：5-CACCTTGGCGATTACAGAAG-3；GAPDH序列：上游：5-CGTGCCGCTGGAGAAACCTG-3；下游：5-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3。 　　加样完成后离心，放入荧光定量PCR仪（ABI Prism？7300型，Corbett research公司，澳大利亚），按以下条件进行Real-time PCR反应：①步骤一：变性，重复1次，95℃，30 s；②步骤二：PCR反应，重复40次，95℃，5 s→60℃，34 s。