实验四聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH徐燕.ppt

试剂 分离胶 浓缩胶 A液(ml) 1.8 B液(ml) 2.0 C液(ml) D液(ml) 0.7 1.4 蒸馏水(ml) 5.0 2.4 1% TEMED(ml) 0.5 0.2 1%过硫酸铵（ml） 0.7 0.3 总体积 10mL 5.0mL 胶浓度 6% 3.5% * 快离子很快移动到最前面，原来它停留在那部分地区则形成了低离子浓度区，即低电导区。低电导区有较高的电位梯度，就引起了电位梯度的突变。这种高电位梯度又使蛋白质阴离子和甘氨酸阴离子在此区域加速前进，追赶快离子。当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立以后，快离子和慢离子之间造成一个不断向正极移动的界面。夹在快、慢离子间的样品蛋白质阴离子的移动界面就在这个追赶中逐渐被压缩，聚集成一条狭窄的区带。浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 * 凝胶的pH值明显增加,并导致甘氨酸的大量解离,有效泳动率增加.甘氨酸的分子量远小于蛋白质,它将赶上并超过各种蛋白质分子直接在氯离子后移动.这时,由于凝胶孔径变小,使蛋白质分子的迁移率减小,于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH环境中泳动,分子迁移速度与分子量大小和形状与其迁移率密切相关,分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面. 实验四 电泳概述及原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色原理 电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Re?ss进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。 原则上按电泳的原理来分，可分为三类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。 稳态电泳：分子颗粒的迁移在一定的时间内即可达到稳态，达到稳态后，带的宽度不随时间而改变。 引 言 引 言 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、 板电泳、柱电泳。 据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。 区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型： 电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。 . 若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F引=E Q （1） 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6πrηV 当F引=F阻时 EQ= 6πrηV V= 由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E) 和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度 (η)成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大 的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。 EQ 6πrη （2） （3） （4） 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 + - 丙烯酰胺（Acr，单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（ Bis，交联剂）→（催化剂）→聚合 催化剂： （1）过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED） （2）核黄素（VitB2）＋光 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。 T为凝胶总浓度，C为交联度。 a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。 凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。