DB37T 2842-2016 鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.docx
ICS11.220B41
DB37
山东省地方标准
DB37/T2842—2016
鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法
AnindirectELISAfordetectionofspecificantibodyagainstTembusuvirus
2016-09-18发布2016-10-18实施
山东省质量技术监督局发布
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DB37/T2842—2016
前言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。
本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。
本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、陈浩、冯强、提金凤、高绪慧。
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DB37/T2842—2016
鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法
1范围
本标准规定了鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法所需试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。
本标准所规定的鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法，适用于检测鸭血清中坦布苏病毒特异性抗体。
2试剂及仪器
2.1试剂
2.1.1阳性血清，SPF鸭接种坦布苏病毒制备的血清。
2.1.2阴性血清，SPF鸭血清。
2.1.3坦布苏病毒抗原：原核表达的重组坦布苏病毒E蛋白。
2.1.4酶标二抗：羊抗鸭辣根过氧化物酶标记的IgG。
2.1.5磷酸盐缓冲液(PBS),见A.1。
2.1.6包被液，见A.2。
2.1.7洗涤液，见A.3。
2.1.8样品稀释液(封闭液),见A.4。
2.1.9底物溶液，商品化TMB底物显色液。
2.1.10终止液，见A.5。
2.2仪器
2.2.1酶标仪。
2.2.2微量加样器。
2.2.3聚苯乙烯板。
2.2.4水平振荡器。
2.2.5恒温培养箱。
3样品准备
3.1待检鸭血清样品，每份不少于200μL,无溶血。
3.2被检血清样品用样品稀释液按1:40倍稀释。
4操作步骤
4.1试验试剂预温到20℃~25℃。
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4.2将抗原按照浓度为2.6ng/μL用碳酸盐缓冲液稀释，每孔100μL加入到96孔聚苯乙烯板中，4℃孵育过夜后，用洗涤液100μL洗板3次，每次置于水平振荡器300r/min震荡3min,甩干板上残余液体。
4.3每孔加入200μL封闭液，37℃温箱孵育1h,用4.2方法洗板。
4.4在A1、A2孔各加100μL阴性血清对照，A3、A4孔各加100μL阳性血清对照。
4.5将待检血清样品加入其他各孔，每孔100μL,37℃温箱孵育1h,用4.2方法洗板。
4.6酶标二抗用样品稀释液按1:500倍稀释，每孔加100μL,37℃孵育1h,用4.2方法洗板。
4.7每孔加100μL底物溶液，37℃避光孵育15min。
4.8每孔加入50μL终止液，轻轻振荡，终止反应。
4.9置酶标仪于450nm测定各孔样品吸光度(OD)值，该操作需30min内完成。
5结果判定
5.1阴性对照OD均值等于(A1孔OD值+A2孔OD值)/2;阳性对照OD均值等于(A3孔OD值+A4孔OD值)/2。
5.2阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差必须大于0.40;阴性对照平均值必须小于等于0.20。试验条件成立，否则重做。
5.3判定：
5.3.1阳性样品OD450≥0.40,待检血清为阳性；即已感染坦布苏病毒。
5.3.2阴性样品OD450≤0.20,待检血清为阴性；即未感染坦布苏病毒。
5.3.3可疑样品0.200D4500.40,判为可疑，重新测定。
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附录A
(规范性附录)
试剂配制
A.1磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/LpH7.4)
NaCl8.0g
KC1